Takk for at du besøker Nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best resultat anbefaler vi at du bruker en nyere versjon av nettleseren din (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I mellomtiden, for å sikre kontinuerlig støtte, viser vi nettstedet uten styling eller JavaScript.
Mikrobiell vekst i sår manifesterer seg ofte som biofilmer, som forstyrrer helbredelsen og er vanskelige å utrydde. Nye sølvbandasjer hevder å bekjempe sårinfeksjoner, men deres antibiofilm-effektivitet og infeksjonsuavhengige helbredelseseffekter er generelt ukjente. Ved å bruke in vitro- og in vivo-biofilmmodeller av Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa, rapporterer vi effektiviteten til Ag1+-ionegenererende bandasjer; Ag1+-bandasjer som inneholder etylendiamintetraeddiksyre og benzetoniumklorid (Ag1+/EDTA/BC), og bandasjer som inneholder sølvnitrat (Ag-oksysalter), som produserer Ag1+-, Ag2+- og Ag3+-ioner for å bekjempe sårbiofilm og dens effekt på helbredelse. Ag1+-bandasjer hadde minimal effekt på sårbiofilm in vitro og hos mus (C57BL/6j). I motsetning til dette reduserte oksygenerte Ag-salter og Ag1+/EDTA/BC-bandasjer betydelig antallet levedyktige bakterier i biofilm in vitro og viste en signifikant reduksjon i bakterielle og EPS-komponenter i musesårsbiofilm. Disse bandasjene hadde ulik effekt på helingen av biofilminfiserte og ikke-biofilminfiserte sår, der oksygenerte saltbandasjer hadde mer gunstige effekter på reepitelisering, sårstørrelse og betennelse sammenlignet med kontrollbehandlinger og andre sølvbandasjer. De forskjellige fysikalsk-kjemiske egenskapene til sølvbandasjer kan ha ulik effekt på sårbiofilm og heling, og dette bør vurderes når man velger en bandasje for behandling av biofilminfiserte sår.
Kroniske sår defineres som «sår som ikke går gjennom de normale stadiene av heling på en ordnet og rettidig måte»1. Kroniske sår skaper en psykologisk, sosial og økonomisk belastning for pasienter og helsesystemet. Årlige NHS-utgifter til behandling av sår og tilhørende komorbiditeter er anslått til 8,3 milliarder pund i 2017–182. Kroniske sår er også for tiden et presserende problem i USA, og Medicare anslår de årlige kostnadene for behandling av pasienter med sår til 28,1–96,8 milliarder dollar3.
Infeksjon er en viktig faktor som forhindrer sårheling. Infeksjoner manifesterer seg ofte som biofilmer, som er tilstede i 78 % av ikke-helende kroniske sår. Biofilmer dannes når mikroorganismer fester seg irreversibelt til overflater, som såroverflater, og kan aggregere seg for å danne ekstracellulær polymer (EPS)-produserende samfunn. Sårbiofilm er assosiert med en økt inflammatorisk respons som fører til vevsskade, som kan forsinke eller forhindre helbredelse4. Økningen i vevsskade kan delvis skyldes økt aktivitet av matriksmetalloproteinaser, kollagenase, elastase og reaktive oksygenarter5. Dessuten er inflammatoriske celler og biofilmer i seg selv høye forbrukere av oksygen og kan derfor forårsake lokal vevshypoksi, noe som tapper celler for det viktige oksygenet som er nødvendig for effektiv vevsreparasjon6.
Modne biofilmer er svært resistente mot antimikrobielle midler, noe som krever aggressive strategier for å kontrollere biofilminfeksjoner, som mekanisk behandling etterfulgt av effektiv antimikrobiell behandling. Fordi biofilmer kan regenerere raskt, kan effektive antimikrobielle midler redusere risikoen for redannelse etter kirurgisk debridement7.
Sølv brukes i økende grad i antimikrobielle bandasjer og brukes ofte som førstelinjebehandling for kronisk infiserte sår. Det finnes mange kommersielt tilgjengelige sølvbandasjer, som hver inneholder en ulik sølvsammensetning, konsentrasjon og basematrise. Fremskritt innen sølvarmbånd har ført til utviklingen av nye sølvarmbånd. Den metalliske formen av sølv (Ag0) er inert. For å oppnå antimikrobiell effektivitet må den miste et elektron for å danne ionisk sølv (Ag1+). Tradisjonelle sølvbandasjer inneholder sølvforbindelser eller metallisk sølv som, når de utsettes for væske, dekomponerer for å danne Ag1+-ioner. Disse Ag1+-ionene reagerer med bakteriecellen og fjerner elektroner fra strukturelle komponenter eller kritiske prosesser som er nødvendige for overlevelse. Patentert teknologi har ført til utviklingen av en ny sølvforbindelse, Ag-oksysalter (sølvnitrat, Ag7NO11), som er inkludert i sårbandasjer. I motsetning til tradisjonelt sølv, produserer dekomponeringen av oksygenholdige salter sølvtilstander med høyere valens (Ag1+, Ag2+ og Ag3+). In vitro-studier har vist at lave konsentrasjoner av oksygenerte sølvsalter er mer effektive enn enkeltionsølv (Ag1+) mot patogene bakterier som Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus og Escherichia coli8,9. En annen ny type sølvbandasje inneholder ytterligere ingredienser, nemlig etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og benzetoniumklorid (BC), som rapporteres å målrette biofilm-EPS og dermed øke penetrasjonen av sølv inn i biofilmen. Disse nye sølvteknologiene tilbyr nye måter å målrette sårbiofilmer på. Imidlertid er virkningen av disse antimikrobielle stoffene på sårmiljøet og infeksjonsuavhengig helbredelse viktig for å sikre at de ikke skaper et ugunstig sårmiljø eller forsinker helbredelse. Bekymringer om in vitro sølvcytotoksisitet har blitt rapportert med flere sølvbandasjer10,11. Imidlertid har in vitro cytotoksisitet ennå ikke oversatt til in vivo-toksisitet, og flere Ag1+ bandasjer har vist en god sikkerhetsprofil12.
Her undersøkte vi effektiviteten av karboksymetylcellulosebandasjer som inneholder nye sølvformuleringer mot sårbiofilm in vitro og in vivo. I tillegg ble effekten av disse bandasjene på immunresponser og heling uavhengig av infeksjon vurdert.
Alle bandasjer som ble brukt var kommersielt tilgjengelige. 3M Kerracel Gel Fiber Dressing (3M, Knutsford, Storbritannia) er en ikke-antimikrobiell 100 % karboksymetylcellulose (CMC) gelfiberbandasje som ble brukt som kontrollbandasje i denne studien. Tre antimikrobielle CMC sølvbandasjer ble evaluert, nemlig 3M Kerracel Ag-bandasje (3M, Knutsford, Storbritannia), som inneholder 1,7 vekt% oksygenert sølvsalt (Ag7NO11) i sølvioner med høyere valens (Ag1+, Ag2+ og Ag3+). Under nedbrytningen av Ag7NO11 dannes Ag1+-, Ag2+- og Ag3+-ioner i forholdet 1:2:4. Aquacel Ag Extra-bandasje som inneholder 1,2 % sølvklorid (Ag1+) (ConvaTec, Deeside, Storbritannia) 13 og Aquacel Ag + Extra-bandasje som inneholder 1,2 % sølvklorid (Ag1+), EDTA og benzetoniumklorid (ConvaTec, Deeside, Storbritannia) 14.
Stammene som ble brukt i denne studien var Pseudomonas aeruginosa NCTC 10781 (Public Health England, Salisbury) og Staphylococcus aureus NCTC 6571 (Public Health England, Salisbury).
Bakterier ble dyrket over natten i Muller-Hinton-buljong (Oxoid, Altrincham, Storbritannia). Overnattingskulturen ble deretter fortynnet 1:100 i Mueller-Hinton-buljong og 200 µl platet ut på sterile 0,2 µm Whatman cyclopore-membraner (Whatman plc, Maidstone, Storbritannia) på Mueller-Hinton-agarplater (Sigma-Aldrich Company Ltd, Kent, Storbritannia). Kolonial biofilmdannelse ved 37 °C i 24 timer. Disse koloniale biofilmene ble testet for logaritmisk krymping.
Klipp bandasjen i 3 cm² store biter og forfukt dem med sterilt avionisert vann. Plasser bandasjen over biofilmen til kolonien på agarplaten. Hver 24. hektar med biofilm ble fjernet, og levedyktige bakterier i biofilmen (CFU/ml) ble kvantifisert ved seriefortynning (10⁻⁹ til 10⁻⁹) i Day-Angle-nøytraliseringsbuljong (Merck-Millipore). Etter 24 timers inkubasjon ved 37 °C ble standard platetellinger utført på Mueller-Hinton agarplater. Hver behandling og tidspunkt ble utført i triplikat, og platetellingene ble gjentatt for hver fortynning.
Svinebugskinn hentes fra hunngriser av typen Large White innen 15 minutter etter slakting i samsvar med EUs eksportstandarder. Huden ble barbert og rengjort med alkoholservietter, og deretter frosset ved -80 °C i 24 timer for å devitalisere huden. Etter tining ble 1 cm2 hudbiter vasket tre ganger med PBS, 0,6 % natriumhypokloritt og 70 % etanol i 20 minutter hver gang. Før epidermis fjernes, fjernes eventuell gjenværende etanol ved å vaske 3 ganger i steril PBS. Huden ble dyrket i en 6-brønns plate med en 0,45 μm tykk nylonmembran (Merck-Millipore) på toppen og 3 absorberende puter (Merck-Millipore) som inneholdt 3 ml føtalt bovint serum (Sigma) tilsatt 10 % Dulbecco's modifiserte Eagle Medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium – Aldrich Ltd.).
Koloniale biofilmer ble dyrket som beskrevet for biofilmeksponeringsstudier. Etter dyrking av biofilmen på membranen i 72 timer, ble biofilmen påført hudoverflaten ved hjelp av en steril inokuleringsløkke, og membranen ble fjernet. Biofilmen ble deretter inkubert på grisens dermis i ytterligere 24 timer ved 37 °C for å la biofilmen modnes og feste seg til grisens hud. Etter at biofilmen hadde modnet og festet seg, ble en 1,5 cm2 bandasje, forhåndsfuktet med sterilt destillert vann, påført direkte på hudoverflaten og inkubert ved 37 °C i 24 timer. Levedyktige bakterier ble visualisert ved farging ved å påføre PrestoBlue-cellelevedyktighetsreagens (Invitrogen, Life Technologies, Paisley, Storbritannia) jevnt på den apikale overflaten av hvert eksplantat og inkubere det i 5 minutter. Bruk Leica DFC425 digitalkamera for å ta bilder umiddelbart på Leica MZ8-mikroskopet. Områder farget rosa ble kvantifisert ved hjelp av Image Pro-programvareversjon 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD Image-Pro (mediacy.com)). Skanningselektronmikroskopi ble utført som beskrevet nedenfor.
Bakterier dyrket over natten ble fortynnet 1:100 i Mueller-Hinton-buljong. 200 μl kultur ble tilsatt til en steril 0,2 μm Whatman cyclopore-membran (Whatman, Maidstone, Storbritannia) og plassert på Mueller-Hinton-agar. Biofilmplater ble inkubert ved 37 °C i 72 timer for å tillate dannelse av moden biofilm.
Etter 3 dager med biofilmmodning ble en 3 cm2 kvadratisk bandasje plassert direkte på biofilmen og inkubert ved 37 °C i 24 timer. Etter at bandasjen var fjernet fra biofilmoverflaten, ble 1 ml PrestoBlue Cell Viability Reagent (Invitrogen, Waltham, MA) tilsatt overflaten av hver biofilm i 20 sekunder. Overflatene ble tørket før fargeendringer ble registrert med et Nikon D2300 digitalkamera (Nikon UK Ltd., Kingston, Storbritannia).
Forbered nattkulturer på Mueller-Hinton-agar, overfør individuelle kolonier til 10 ml Mueller-Hinton-buljong og inkuber på en ristemaskin ved 37 °C (100 rpm). Etter inkubasjon over natten ble kulturen fortynnet 1:100 i Mueller-Hinton-buljong og 300 µl ble dryppet på en 0,2 µm sirkulær Whatman cyclopore-membran (Whatman International, Maidstone, Storbritannia) på Mueller-Hinton-agar og inkubert ved 37 °C innen 72 timer. Den modne biofilmen ble påført såret som beskrevet nedenfor.
Alt arbeid med dyr ble utført ved University of Manchester under en prosjektlisens godkjent av Office of Animal Welfare and Ethical Review (P8721BD27) og i samsvar med retningslinjer publisert av Home Office under den reviderte ASPA fra 2012. Alle forfattere fulgte ankomstretningslinjene. Åtte uker gamle C57BL/6j-mus (Envigo, Oxon, Storbritannia) ble brukt til alle in vivo-studier. Musene ble bedøvet med isofluran (Piramal Critical Care Ltd, West Drayton, Storbritannia), og deres dorsale overflater ble barbert og rengjort. Hver mus fikk deretter et 2 × 6 mm eksisjonssår ved hjelp av en Stiefel biopsipunch (Schuco International, Hertfordshire, Storbritannia). For biofilminfiserte sår, påfør 72-timers kolonial biofilm dyrket på membranen som beskrevet ovenfor på sårets dermale lag ved hjelp av en steril inokuleringsløkke umiddelbart etter skaden, og membranen kastes. En kvadratcentimeter bandasje fuktes på forhånd med sterilt vann for å opprettholde et fuktig sårmiljø. Bandasjer ble påført direkte på hvert sår og dekket med 3M Tegaderm-film (3M, Bracknell, Storbritannia) og Mastisol flytende lim (Eloquest Healthcare, Ferndale, MI) påført rundt kantene for å gi ytterligere heft. Buprenorfin (Animalcare, York, Storbritannia) ble administrert i en konsentrasjon på 0,1 mg/kg som smertestillende middel. Musene ble avlivet tre dager etter skaden ved hjelp av Schedule 1-metoden, og sårområdet ble fjernet, halvert og lagret etter behov.
Hematoksylin (ThermoFisher Scientific) og eosin (ThermoFisher Scientific) farging ble utført i henhold til produsentens protokoll. Sårareal og reepitelisering ble kvantifisert ved hjelp av Image Pro-programvareversjon 10 (Media Cybernetics Inc, Rockville, MD).
Vevsseksjoner ble avvokset i xylen (ThermoFisher Scientific, Loughborough, Storbritannia), rehydrert med 100–50 % gradert etanol og kortvarig nedsenket i avionisert vann (ThermoFisher Scientific). Immunhistokjemi ble utført ved bruk av VectaStain Elite ABC PK-6104-settet (Vector Laboratories, Burlingame, CA) i henhold til produsentens protokoll. Primære antistoffer mot nøytrofiler NIMP-R14 (Thermofisher Scientific) og makrofager Ms CD107b Pure M3/84 (BD Biosciences, Wokingham, Storbritannia) ble fortynnet 1:100 i blokkeringsløsning og tilsatt snittflaten, etterfulgt av 2 antistoffer Anti-, VectaStain ABC og Vector Nova Red Peroxidase (HRP) substratsett (Vector Laboratories, Burlingame, CA) og motfarget med hematoksylin. Bildene ble tatt med et Olympus BX43-mikroskop og et Olympus DP73 digitalkamera (Olympus, Southend-on-Sea, Storbritannia).
Hudprøver ble fiksert i 2,5 % glutaraldehyd og 4 % formaldehyd i 0,1 M HEPES (pH 7,4) i 24 timer ved 4 °C. Prøvene ble dehydrert ved bruk av gradert etanol og tørket i CO2 ved bruk av en Quorum K850 kritisk punkttørker (Quorum Technologies Ltd, Loughton, Storbritannia) og sputterbelagt med gull-palladium-legering ved bruk av et Quorum SC7620 mini sputterer/glødeutladningssystem. Prøvene ble avbildet ved bruk av et FEI Quanta 250 skanningselektronmikroskop (ThermoFisher Scientific) for å visualisere sårets sentrale punkt.
Toto-1-jodid (2 μM) ble påført den utskårne musesåroverflaten og inkubert i 5 minutter ved 37 °C (ThermoFisher Scientific) og behandlet med Syto-60 (10 μM) ved 37 °C (ThermoFisher Scientific). 15-minutters Z-stack-bilder ble laget med en Leica TCS SP8.
Biologiske og tekniske replikatdata ble tabulert og analysert ved hjelp av Graphpad Prism V9-programvare (GraphPad Software, La Jolla, CA). Enveis variansanalyse med multiple sammenligninger ved bruk av Dunnetts post hoc-test ble brukt til å teste for forskjeller mellom hver behandling og den ikke-antimikrobielle kontrollbandasjen. En p-verdi <0,05 ble ansett som signifikant.
Effektiviteten til sølvgel-fiberbandasjer ble først vurdert mot biofilmkolonier av Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa in vitro. Sølvbandasjer inneholder forskjellige formler av sølv: tradisjonelle sølvbandasjer produserer Ag1+-ioner; sølvbandasjer, som kan produsere Ag1+-ioner etter tilsetning av EDTA/BC, kan ødelegge biofilmmatrisen og eksponere bakterier for sølv under den antibakterielle effekten av sølvioner15 og bandasjer som inneholder oksygenerte Ag-salter som produserer Ag1+-, Ag2+- og Ag3+-ioner. Effektiviteten ble sammenlignet med en ikke-antimikrobiell kontrollbandasje laget av gelerte fibre. Gjenværende levedyktige bakterier i biofilmen ble vurdert hver 24. time i 8 dager (figur 1). På dag 5 ble biofilmen reinokulert med 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus eller 1,22 × 105P. aeruginosa for å vurdere biofilmgjenoppretting. Sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrollbandasjer hadde Ag1+-bandasjer minimal effekt på bakteriell levedyktighet i biofilmer av Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa over 5 dager. I motsetning til dette var bandasjer som inneholdt oksygenert Ag og Ag1+ + EDTA/BC-salter effektive til å drepe bakterier i biofilmen innen 5 dager. Etter gjentatt inokulering med planktoniske bakterier på dag 5 ble det ikke observert noen gjenoppretting av biofilmen (fig. 1).
Kvantifisering av levedyktige bakterier i biofilmer av Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa etter behandling med sølvbandasjer. Biofilmkolonier av Staphylococcus aureus og Pseudomonas aeruginosa ble behandlet med sølvbandasjer eller ikke-antimikrobielle kontrollbandasjer, og antallet gjenværende levedyktige bakterier ble bestemt hver 24. time. Etter 5 dager ble biofilmen reinokulert med 3,85 × 105S. Staphylococcus aureus eller 1,22 × 105P. Kolonier av bakterioplanktonet Pseudomonas aeruginosa ble dannet individuelt for å vurdere biofilmgjenoppretting. Grafer viser gjennomsnitt +/- standardfeil.
For å visualisere effekten av sølvbandasjer på biofilmens levedyktighet ble bandasjer påført modne biofilmer dyrket på grisehud ex vivo. Etter 24 timer fjernes bandasjen, og biofilmen farges med et blått reaktivt fargestoff, som metaboliseres av levende bakterier til en rosa farge. Biofilmer behandlet med kontrollbandasjer var rosa, noe som indikerer tilstedeværelsen av levedyktige bakterier i biofilmen (figur 2A). I motsetning til dette var biofilmen behandlet med Ag-oksysolbandasjen primært blå, noe som indikerer at de gjenværende bakteriene på overflaten av grisehuden var ikke-levedyktige bakterier (figur 2B). Blandet blå og rosa farge ble observert i biofilmer behandlet med Ag1+-holdige bandasjer, noe som indikerer tilstedeværelsen av levedyktige og ikke-levedyktige bakterier i biofilmen (figur 2C), mens EDTA/BC-bandasjer som inneholdt Ag1+ var overveiende blå med noen rosa flekker, noe som indikerer områder som ikke var påvirket av sølvbandasjen (figur 2D). Kvantifisering av aktive (rosa) og inaktive (blå) områder viste at kontrollplasteret var 75 % aktivt (figur 2E). Ag1+ + EDTA/BC-bandasjer fungerte på samme måte som oksygenerte Ag-saltbandasjer, med overlevelsesrater på henholdsvis 13 % og 14 %. Ag1+-bandasjen reduserte også bakteriell levedyktighet med 21 %. Disse biofilmene ble deretter observert ved hjelp av skanningselektronmikroskopi (SEM). Etter behandling med kontrollbandasjen og Ag1+-bandasjen ble det observert et lag med Pseudomonas aeruginosa som dekket svinehuden (figur 2F, H), mens det etter behandling med Ag1+-bandasjen ble funnet få bakterieceller og få bakterieceller under. Kollagenfibre kan betraktes som vevsstrukturen til svinehud (figur 2G). Etter behandling med Ag1+ + EDTA/BC-bandasje var bakterieplakk og underliggende kollagenfiberplakk synlige (figur 2I).
Visualisering av Pseudomonas aeruginosa-biofilm etter behandling med sølvforbinding. (A–D) Bakteriell levedyktighet i Pseudomonas aeruginosa-biofilmer dyrket på grisehud ble visualisert ved bruk av PrestoBlue-levedyktighetsfargestoff 24 timer etter behandling med sølvforbindinger eller ikke-antimikrobielle kontrollforbindinger. Levende bakterier er rosa, ikke-levedyktige bakterier og grisehud er blå. (E) Kvantifisering av Pseudomonas aeruginosa-biofilmer dyrket på grisehud (rosa flekk) ved bruk av skanningselektronmikroskopi Image Pro versjon 10 (FI) og behandlet med en sølvforbinding eller en ikke-antimikrobiell kontrollforbinding i 24 timer. SEM-skalabar = 5 µm. (J–M) Koloniale biofilmer vokste på filtre og ble farget med PrestoBlue-reaktivt fargestoff etter 24 timers inkubasjon med sølvforbindinger.
For å avgjøre om nær kontakt mellom bandasjene og biofilmene påvirket bandasjenes effektivitet, ble koloniale biofilmer plassert på en flat overflate behandlet med bandasjene i 24 timer og deretter farget med reaktive fargestoffer. Den ubehandlede biofilmen var mørk rosa i fargen (figur 2J). I motsetning til biofilmer behandlet med bandasjer som inneholdt oksygenerte Ag-salter (figur 2K), viste biofilmer behandlet med bandasjer som inneholdt Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC bånd med rosa farging (figur 2L,M). Denne rosa fargen indikerer tilstedeværelsen av levedyktige bakterier og er assosiert med suturområdet i bandasjen. Disse innsydde områdene skaper døde rom som lar bakterier i biofilmen overleve.
For å evaluere effektiviteten av sølvbandasjer in vivo ble fulltykkelses utskårne sår fra mus infisert med modne S. aureus- og P. aeruginosa-biofilmer behandlet med ikke-antimikrobielle kontrollbandasjer eller sølvbandasjer. Etter 3 dagers behandling viste makroskopisk bildeanalyse mindre sårstørrelser ved behandling med oksygenerte saltbandasjer sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrollbandasjer og andre sølvbandasjer (figur 3A-H). For å bekrefte disse observasjonene ble sår samlet inn, og sårareal og reepitelisering ble kvantifisert på hematoksylin- og eosin-fargede vevssnitt ved bruk av Image Pro-programvareversjon 10 (figur 3I-L).
Effekten av sølvbandasjer på såroverflaten og reepitelisering av sår infisert med biofilm. (A–H) Små celler infisert med biofilm av Pseudomonas aeruginosa (A–D) og Staphylococcus aureus (E–H) etter tre dagers behandling med en ikke-antimikrobiell kontrollbandasje, en oksygenert Ag-saltbandasje, en Ag1+ bandasje og en Ag1+ bandasje. Representative makroskopiske bilder. Sår fra mus med Ag1+ + EDTA/BC-bandasje. (IL) Representativ Pseudomonas aeruginosa-infeksjon, histologiske snitt farget med hematoksylin og eosin, brukt til å kvantifisere sårareal og epitelregenerering. Kvantifisering av sårareal (M, O) og prosentvis reepitelisering (N, P) av sår infisert med Pseudomonas aeruginosa (M, N) og Staphylococcus aureus (O, P) biofilm (per behandlingsgruppe n = 12). Grafer viser gjennomsnittlig +/- standardfeil. * betyr p = < 0,05 ** betyr p = < 0,01; Makroskopisk skala = 2,5 mm, histologisk skala = 500 µm.
Kvantifisering av sårareal i sår infisert med Pseudomonas aeruginosa biofilm (figur 3M) viste at sår behandlet med Ag-oksysalter hadde en gjennomsnittlig sårstørrelse på 2,5 mm2, mens den ikke-antimikrobielle kontrollbandasjen hadde en gjennomsnittlig sårstørrelse på 3,1 mm2, noe som ikke stemmer. oppnådde statistisk signifikans (figur 3M). p = 0,423). Sår behandlet med Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC viste ingen reduksjon i sårareal (henholdsvis 3,1 mm2 og 3,6 mm2). Behandling med oksygenert Ag-saltbandasje fremmet reepitelisering i større grad enn den ikke-antimikrobielle kontrollbandasjen (henholdsvis 34 % og 15 %; p = 0,029) og Ag1+ eller Ag1+ + EDTA/BC (henholdsvis 10 % og 11 %) (figur 3N).
Lignende trender i sårareal og epitelregenerering ble observert i sår infisert med S. aureus-biofilm (figur 3O). Bandasjer som inneholder oksygenerte sølvsalter reduserte sårarealet (2,0 mm2) med 23 % sammenlignet med kontrollbandasjen uten antimikrobiell behandling (2,6 mm2), selv om denne reduksjonen ikke var signifikant (p = 0,304) (figur 3O). I tillegg var sårarealet i Ag1+-behandlingsgruppen noe redusert (2,4 mm2), mens såret behandlet med Ag1+ + EDTA/BC-bandasje ikke reduserte sårarealet (2,9 mm2). Oksygensalter av Ag fremmet også reepitelisering av sår infisert med S. aureus-biofilm (31 %) i større grad enn de som ble behandlet med ikke-antimikrobielle kontrollbandasjer (12 %, p = 0,003) (figur 3P). Ag1+-bandasje (16 %, p = 0,903) og Ag+1 + EDTA/BC-bandasje (14 %, p = 0,965) viste nivåer av epitelial regenerering som var tilsvarende kontrollgruppen.
For å visualisere effekten av sølvbandasjer på biofilmmatrisen ble det utført Toto 1- og Syto 60-jodidfarging (fig. 4). Toto 1-jodid er et celleugjennomtrengelig fargestoff som kan brukes til å visualisere ekstracellulære nukleinsyrer nøyaktig, som er rikelig forekommende i EPS i biofilmer. Syto 60 er et cellegjennomtrengelig fargestoff som brukes som motfarging16. Observasjoner av Toto 1- og Syto 60-jodid i sår inokulert med biofilmer av Pseudomonas aeruginosa (figur 4A-D) og Staphylococcus aureus (figur 4I-L) viste at etter 3 dagers bandasjebehandling var EPS i biofilmen betydelig redusert. EPS inneholdt oksygenerte salter Ag og Ag1+ + EDTA/BC. Ag1+-bandasjer uten ekstra antibiofilmkomponenter reduserte cellefritt DNA betydelig i sår inokulert med Pseudomonas aeruginosa, men var mindre effektive i sår inokulert med Staphylococcus aureus.
In vivo-avbildning av sårbiofilm etter 3 dagers behandling med kontroll- eller sølvbandasjer. Konfokale bilder av Pseudomonas aeruginosa (A–D) og Staphylococcus aureus (I–L) farget med Toto 1 (grønn) for å visualisere ekstracellulære nukleinsyrer, en komponent i ekstracellulære biofilmpolymerer. For å farge intracellulære nukleinsyrer, bruk Syto 60 (rød). syrer. P. Skanningselektronmikroskopi av sår infisert med Pseudomonas aeruginosa (E–H) og Staphylococcus aureus (M–P) biofilm etter 3 dagers behandling med kontroll- og sølvbandasjer. SEM-skalabar = 5 µm. Konfokal avbildningsskalabar = 50 µm.
Skanningselektronmikroskopi viste at mus inokulert med biofilmkolonier av Pseudomonas aeruginosa (figur 4E-H) og Staphylococcus aureus (figur 4M-P) hadde betydelig færre bakterier i sårene sine etter 3 dagers behandling med kun sølvbandasjer.
For å evaluere effekten av sølvbandasjer på sårbetennelse hos biofilminfiserte mus, ble seksjoner av biofilminfiserte sår behandlet med kontroll- eller sølvbandasjer i 3 dager immunhistokjemisk farget ved bruk av antistoffer spesifikke for nøytrofiler og makrofager. Kvantitativ bestemmelse av nøytrofiler og makrofager internt. granulasjonsvev. Figur 5). Alle sølvbandasjer reduserte antallet nøytrofiler og makrofager i sår infisert med Pseudomonas aeruginosa sammenlignet med ikke-antimikrobielle kontrollbandasjer etter tre dagers behandling. Behandling med den oksygenerte sølvsaltbandasjen resulterte imidlertid i en større reduksjon i nøytrofiler (p = <0,0001) og makrofager (p = <0,0001) sammenlignet med andre testede sølvbandasjer (figur 5I,J). Selv om Ag1+ + EDTA/BC hadde en større effekt på sårbiofilm, reduserte det nøytrofil- og makrofagnivåene i mindre grad enn Ag1+ bandasjen. Moderate sår infisert med S. aureus biofilm ble også observert etter bandasjering med Ag (p = <0,0001), Ag1+ (p = 0,0008) og Ag1++ EDTA/BC (p = 0,0043) oksisoler sammenlignet med kontrollgruppen. Lignende trender observeres for nøytropenibandasje (fig. 5K). Imidlertid viste bare den oksygenerte Ag-saltbandasjen en signifikant reduksjon i antall makrofager i granulasjonsvev sammenlignet med kontrollgruppen i sår infisert med S. aureus biofilm (p = 0,0339) (figur 5L).
Nøytrofiler og makrofager ble kvantifisert i sår infisert med Pseudomonas aeruginosa- og Staphylococcus aureus-biofilmer etter 3 dagers behandling med ikke-antimikrobiell kontroll- eller sølvbandasje. Nøytrofiler (AD) og makrofager (EH) ble kvantifisert i vevssnitt farget med antistoffer spesifikke for nøytrofiler eller makrofager. Kvantifisering av nøytrofiler (I og K) og makrofager (J og L) i sår infisert med Pseudomonas aeruginosa- (I og J)- og Staphylococcus aureus- (K & L)-biofilmer. N = 12 per gruppe. Grafene viser gjennomsnitt +/- standardfeil, signifikansverdier sammenlignet med ikke-antibakteriell kontrollbandasje, * betyr p = < 0,05, ** betyr p = < 0,01; *** betyr p = < 0,001; indikerer p = < 0,0001).
Deretter vurderte vi effekten av sølvbandasjer på infeksjonsuavhengig heling. Ikke-infiserte eksisjonssår ble behandlet med en ikke-antimikrobiell kontrollbandasje eller en sølvbandasje i 3 dager (figur 6). Blant sølvbandasjene som ble testet, var det bare sår behandlet med oksygenert saltbandasje som virket mindre på makroskopiske bilder enn sår behandlet med kontrollgruppen (figur 6A-D). Kvantifisering av sårareal ved hjelp av histologisk analyse viste at gjennomsnittlig sårareal etter behandling med Ag-oksysolbandasjen var 2,35 mm2 sammenlignet med 2,96 mm2 for sår behandlet med kontrollgruppen, men denne forskjellen nådde ikke statistisk signifikans (p = 0,488) (fig. 6I). Derimot ble det ikke observert noen reduksjon i sårareal etter behandling med Ag1+ (3,38 mm2, p = 0,757) eller Ag1+ + EDTA/BC (4,18 mm2, p = 0,054) bandasjer sammenlignet med kontrollgruppen. Økt epitelregenerering ble observert med Ag-oksysolbandasjen sammenlignet med kontrollgruppen (henholdsvis 30 % vs. 22 %), selv om dette ikke nådde signifikans (p = 0,067). Dette er ganske signifikant og bekrefter tidligere resultater. En bandasje med oksysoler fremmer reepitelisering. -Epitelisering av uinfiserte sår17. I motsetning til dette hadde behandling med Ag1+- eller Ag1+ + EDTA/BC-bandasjer ingen effekt eller viste redusert reepitelisering sammenlignet med kontrollgruppen.
Effekt av sølvbandasje på sårtilheling hos uinfiserte mus med fullstendig reseksjon. (AD) Representative makroskopiske bilder av sår etter tre dagers behandling med en ikke-antimikrobiell kontrollbandasje og en sølvbandasje. (EH) Representative sårsnitt farget med hematoksylin og eosin. Kvantifisering av sårareal (I) og prosentandel av reepitelisering (J) ble beregnet fra histologiske snitt ved sårets midtpunkt ved hjelp av bildeanalyseprogramvare (n = 11–12 per behandlingsgruppe). Grafer viser gjennomsnitt +/- standardfeil. * gjennomsnitt p = <0,05.
Sølv har en lang historie med bruk som antimikrobiell terapi ved sårheling, men de mange forskjellige formuleringene og leveringsmetodene kan føre til forskjeller i antimikrobiell effekt 18. Dessuten er ikke antibiofilmegenskapene til spesifikke sølvleveringssystemer fullt ut forstått. Selv om vertens immunrespons er relativt effektiv mot planktoniske bakterier, er den generelt mindre effektiv mot biofilm 19. Planktoniske bakterier fagocyteres lett av makrofager, men innenfor biofilmer utgjør aggregerte celler ytterligere problemer ved å begrense vertsresponsen i den grad at immunceller kan gjennomgå apoptose og frigjøre proinflammatoriske faktorer for å forbedre immunresponsen 20. Det har blitt observert at noen leukocytter kan trenge inn i biofilm 21, men ikke er i stand til å fagocytere bakterier når dette forsvaret er kompromittert 22. En helhetlig tilnærming bør brukes for å støtte vertens immunrespons mot sårbiofilminfeksjon. Sårdebridering kan fysisk forstyrre biofilmen og fjerne mesteparten av biobyrden, men vertens immunrespons kan være ineffektiv mot gjenværende biofilm, spesielt hvis vertens immunrespons er kompromittert. Antimikrobielle behandlinger som sølvbandasjer kan dermed støtte vertens immunrespons og eliminere biofilminfeksjoner. Sammensetning, konsentrasjon, løselighet og leveringssubstrat kan påvirke den antimikrobielle effektiviteten til sølv. I de senere år har fremskritt innen sølvbehandlingsteknologi gjort disse bandasjene mer effektive9,23. Etter hvert som sølvbandasjeteknologien utvikler seg, er det viktig å forstå effektiviteten til disse bandasjene i å kontrollere sårinfeksjon og, enda viktigere, virkningen av disse potente formene for sølv på sårmiljøet og helbredelsen.
I denne studien sammenlignet vi effektiviteten til to avanserte sølvbandasjer med konvensjonelle sølvbandasjer som produserer Ag1+-ioner mot biofilmer ved bruk av forskjellige in vitro- og in vivo-modeller. Vi vurderte også effekten av disse bandasjene på sårmiljøet og infeksjonsuavhengig heling. For å minimere påvirkningen av leveringsmatrisen, var alle testede sølvbandasjer sammensatt av karboksymetylcellulose.
Vår foreløpige evaluering av disse sølvbandasjene mot koloniale biofilmer av Pseudomonas aeruginosa og Staphylococcus aureus viser at, i motsetning til tradisjonelle Ag1+ bandasjer, er to avanserte sølvbandasjer, Ag1+ + EDTA/BC og oksygenerte Ag-salter, effektive ved 5. De dreper effektivt biofilmbakterier i løpet av få dager. I tillegg forhindrer disse bandasjene redannelse av biofilm ved gjentatt eksponering for planktoniske bakterier. Ag1+ bandasjen inneholdt sølvklorid, samme sølvforbindelse og basematrise som Ag1+ + EDTA/BC, og hadde en begrenset effekt på bakteriell levedyktighet i biofilmen i samme periode. Observasjonen om at en Ag1+ + EDTA/BC bandasje var mer effektiv mot biofilm enn en Ag1+ bandasje bestående av samme matrise og en sølvforbindelse støtter antagelsen om at ytterligere ingredienser er nødvendige for å øke effektiviteten til sølvklorid mot biofilm, slik det har blitt rapportert andre steder15. Disse resultatene støtter ideen om at BC og EDTA spiller en ytterligere rolle i å bidra til den generelle bandasjeeffektiviteten, og at fraværet av denne komponenten i Ag1+ bandasjer kan ha bidratt til at det ikke ble demonstrert in vitro-effekt. Vi fant at oksygenerte Ag-saltbandasjer som produserer Ag2+ og Ag3+ ioner viste sterkere antibakteriell effekt enn Ag1+ og på nivåer som ligner på Ag1+ + EDTA/BC. På grunn av det høye redokspotensialet er det imidlertid uklart hvor lenge Ag3+ ioner forblir aktive og effektive mot sårbiofilm, og derfor fortjener videre studier. I tillegg finnes det mange forskjellige bandasjer som genererer Ag1+ ioner som ikke ble testet i denne studien. Disse bandasjene er sammensatt av forskjellige sølvforbindelser, konsentrasjoner og basematriser, som kan påvirke tilførselen av Ag1+ ioner og deres effektivitet mot biofilm. Det er også verdt å merke seg at det finnes mange forskjellige in vitro- og in vivo-modeller som brukes til å evaluere effektiviteten av sårbandasjer mot biofilm. Typen modell som brukes, samt salt- og proteininnholdet i mediet som brukes i disse modellene, vil påvirke bandasjens effektivitet. I vår in vivo-modell lot vi biofilmen modnes in vitro og overførte den deretter til sårets dermale overflate. Vertsmusens immunrespons er relativt effektiv mot planktoniske bakterier som påføres såret, og danner dermed en biofilm etter hvert som såret leges. Tilsetning av moden biofilm til et sår begrenser effektiviteten av vertsmusens immunrespons på biofilmdannelse ved å la den modne biofilmen etablere seg i såret før helbredelsen kan begynne. Dermed lar modellen vår oss evaluere effektiviteten av antimikrobielle bandasjer på modne biofilmer før sår begynner å gro.
Vi fant også at bandasjens passform påvirket effektiviteten til sølvbandasjer på in vitro-dyrkede biofilmer og svinehud. Nær kontakt med såret anses som kritisk for bandasjens antimikrobielle effektivitet24,25. Bandasjer som inneholdt oksygenerte Ag-salter var i nær kontakt med modne biofilmer, noe som resulterte i en betydelig reduksjon i antall levedyktige bakterier i biofilmen etter 24 timer. I motsetning til dette, når de ble behandlet med Ag1+ og Ag1+ + EDTA/BC-bandasjer, forble et betydelig antall levedyktige bakterier. Disse bandasjene inneholder suturer langs hele bandasjens lengde, noe som skaper døde rom som forhindrer nær kontakt med biofilmen. I våre in vitro-studier forhindret disse ikke-kontaktområdene dreping av levedyktige bakterier i biofilmen. Vi vurderte bakteriell levedyktighet først etter 24 timers behandling. Over tid, etter hvert som bandasjen blir mer mettet, kan det være mindre dødt rom, noe som reduserer arealet for disse levedyktige bakteriene. Dette fremhever imidlertid viktigheten av bandasjens sammensetning, ikke bare typen sølv i bandasjen.
Selv om in vitro-studier er nyttige for å sammenligne effektiviteten til ulike sølvteknologier, er det også viktig å forstå effektene av disse bandasjene på biofilm in vivo, der vertsvev og immunresponser bidrar til bandasjenes effektivitet mot biofilm. Effekten av disse bandasjene på sårbiofilm ble observert ved hjelp av skanningselektronmikroskopi og EPS-farging av biofilmen ved hjelp av intracellulære og ekstracellulære DNA-fargestoffer. Vi fant at etter 3 dagers behandling var alle bandasjene effektive i å redusere cellefritt DNA i biofilminfiserte sår, men Ag1+ bandasjen var mindre effektiv i Staphylococcus aureus-infiserte sår. Skanningselektronmikroskopi viste også at det var betydelig færre bakterier tilstede i sår behandlet med sølvbandasjene, selv om dette var mer uttalt med den oksygenerte Ag-saltbandasjen og Ag1+ + EDTA/BC-bandasjen sammenlignet med Ag1+ bandasjen. Disse dataene viser at de testede sølvbandasjene hadde varierende grad av innvirkning på biofilmstrukturen, men ingen av sølvbandasjene klarte å utrydde biofilmen, noe som støtter behovet for en helhetlig tilnærming til behandling av sårbiofilminfeksjoner; bruk av sølvarmbånd. Behandlingen innledes med fysisk debridement for å fjerne mesteparten av biofilmen.
Kroniske sår er ofte i en tilstand av alvorlig betennelse, med overskudd av inflammatoriske celler som forblir i sårvevet over lengre tid, noe som forårsaker vevsskade og reduserer oksygenet som er nødvendig for effektiv cellulær metabolisme og funksjon i såret26. Biofilmer forverrer dette fiendtlige sårmiljøet ved å påvirke helbredelsen negativt på en rekke måter, inkludert hemming av celleproliferasjon og -migrasjon og aktivering av proinflammatoriske cytokiner27. Etter hvert som sølvbandasjer blir mer effektive, er det viktig å forstå hvilken innvirkning de har på sårmiljøet og helbredelsen.
Interessant nok, selv om alle sølvbandasjer påvirket biofilmsammensetningen, var det bare oksygenerte sølvsaltbandasjer som økte reepiteliseringen av disse infiserte sårene. Disse dataene støtter våre tidligere funn17 og de til Kalan et al. (2017)28, som viste gode sikkerhets- og toksisitetsprofiler for oksygenerte sølvsalter, ettersom lavere konsentrasjoner av sølv var effektive mot biofilm.
Vår nåværende studie fremhever forskjellene i sølvteknologi mellom antimikrobielle sølvbandasjer og effekten av denne teknologien på sårmiljøet og infeksjonsuavhengig heling. Disse resultatene skiller seg imidlertid fra tidligere studier som viser at Ag1+ + EDTA/BC-bandasje forbedret helingsparametrene for skadde kaninører in vivo. Dette kan imidlertid skyldes forskjeller i dyremodeller, måletidspunkter og bakterielle påføringsmetoder29. I dette tilfellet ble sårmålinger tatt 12 dager etter skaden for å la bandasjens aktive ingredienser virke på biofilmen over en lengre periode. Dette støttes av en studie som viste at klinisk infiserte leggsår behandlet med Ag1+ + EDTA/BC først økte i størrelse etter én ukes behandling, og deretter i løpet av de neste 3 ukene med behandling med Ag1+ + EDTA/BC og innen 4 uker etter bruk av ikke-antimikrobielle legemidler. CMC-bandasjer for å redusere størrelsen på sår30.
Visse former og konsentrasjoner av sølv har tidligere vist seg å være cytotoksiske in vitro 11, men disse in vitro-resultatene fører ikke alltid til bivirkninger in vivo. I tillegg har fremskritt innen sølvteknologi og en bedre forståelse av sølvforbindelser og konsentrasjoner i bandasjer ført til utviklingen av mange trygge og effektive sølvbandasjer. Etter hvert som sølvbandasjeteknologien utvikler seg, er det imidlertid viktig å forstå virkningen av disse bandasjene på sårmiljøet 31, 32, 33. Det ble tidligere rapportert at den økte raten av reepitelisering tilsvarer en økt andel antiinflammatoriske M2-makrofager sammenlignet med den proinflammatoriske M1-fenotypen. Dette ble observert i en tidligere musemodell der sølvhydrogel-sårbandasjer ble sammenlignet med sølvsulfadiazin og ikke-antimikrobielle hydrogeler 34.
Kroniske sår kan vise overdreven betennelse, og det har blitt observert at tilstedeværelsen av overskytende nøytrofiler kan være skadelig for sårheling35. I en studie på mus med færre nøytrofiler forsinket tilstedeværelsen av nøytrofiler reepiteliseringen. Tilstedeværelsen av overskytende nøytrofiler fører til høye nivåer av proteaser og reaktive oksygenforbindelser, som superoksid og hydrogenperoksid, som er assosiert med kroniske og saktehelende sår37,38. På samme måte kan en økning i antall makrofager, hvis den er ukontrollert, føre til forsinket sårheling39. Denne økningen er spesielt viktig hvis makrofager ikke klarer å gå over fra en proinflammatorisk fenotype til en prohelende fenotype, noe som resulterer i at sår ikke går ut av den inflammatoriske helingsfasen40. Vi observerte en reduksjon i nøytrofiler og makrofager i biofilminfiserte sår etter 3 dagers behandling med kun sølvbandasjer, men reduksjonen var mer uttalt med oksygenerte saltbandasjer. Denne reduksjonen kan være et direkte resultat av immunresponsen på sølv, en respons på redusert biobyrde, eller at såret er i et senere stadium av helbredelsen, og derfor er immuncellene i såret redusert. Å redusere antallet inflammatoriske celler i såret kan opprettholde et miljø som bidrar til sårheling. Virkningsmekanismen for hvordan Ag-oksysalter fremmer infeksjonsuavhengig helbredelse er uklar, men Ag-oksysalters evne til å produsere oksygen og ødelegge skadelige nivåer av hydrogenperoksid, en mediator av betennelse, kan forklare dette og krever videre studier17.
Kroniske, ikke-helende, infiserte sår er et problem for både leger og pasienter. Selv om mange bandasjer hevder å være antimikrobielle, fokuserer forskningen sjelden på andre viktige faktorer som påvirker sårets mikromiljø. Denne studien viser at ulike sølvteknologier har ulik antimikrobiell effekt og, viktigst av alt, ulike effekter på sårmiljøet og helbredelsen, uavhengig av infeksjon. Selv om disse in vitro- og in vivo-studiene viser effektiviteten til disse bandasjene i behandling av sårinfeksjoner og fremme av helbredelse, er det behov for randomiserte kontrollerte studier for å evaluere effektiviteten til disse bandasjene i klinikken.
Datasettene som ble brukt og/eller analysert i løpet av den nåværende studien er tilgjengelige fra den korresponderende forfatteren på rimelig forespørsel.
Publisert: 15. juli 2024