Takk for at du besøker nature.com. Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte. For best mulig opplevelse anbefaler vi at du bruker den nyeste nettleserversjonen (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer). I tillegg, for å sikre fortsatt støtte, vil dette nettstedet være fritt for stiler og JavaScript.
Skjelettmuskulatur er et heterogent vev som hovedsakelig består av myofibriller, som hos mennesker vanligvis klassifiseres i tre typer: én "langsom" (type 1) og to "raske" (type 2A og 2X). Imidlertid er heterogenitet mellom og innenfor tradisjonelle myofibriltyper fortsatt dårlig forstått. Vi anvendte transkriptomiske og proteomiske tilnærminger på henholdsvis 1050 og 1038 individuelle myofibriller fra human vastus lateralis. Den proteomiske studien inkluderte menn, og den transkriptomiske studien inkluderte 10 menn og 2 kvinner. I tillegg til myosin tungkjede-isoformer, identifiserte vi metabolske proteiner, ribosomale proteiner og cellulære forbindelsesproteiner som kilder til flerdimensjonal intermyofibrilvariabilitet. Til tross for identifiseringen av klynger av langsomme og raske fibre, tyder dataene våre på at type 2X-fibre fenotypisk ikke kan skilles fra andre hurtigrykkende fibre. Videre er myosin tungkjede-basert klassifisering utilstrekkelig til å beskrive myofiberfenotypen i nemaline myopatier. Samlet sett tyder dataene våre på flerdimensjonal myofiber-heterogenitet, med variasjonskilder som strekker seg utover myosin tungkjede-isoformer.
Cellulær heterogenitet er et iboende trekk ved alle biologiske systemer, som lar celler spesialisere seg for å møte de ulike behovene til vev og celler.1 Det tradisjonelle synet på heterogenitet i skjelettmuskulaturfibre har vært at motoriske nevroner definerer fibertypen innenfor en motorisk enhet, og at fibertypen (dvs. type 1, type 2A og type 2X hos mennesker) bestemmes av egenskapene til myosin tungkjede (MYH) isoformer.2 Dette var opprinnelig basert på deres pH ATPase-ustabilitet,3,4 og senere på deres molekylære uttrykk av MYH.5 Med identifiseringen og påfølgende aksept av "blandede" fibre som uttrykker flere MYH-er i varierende proporsjoner, blir skjelettmuskulaturfibre i økende grad sett på som et kontinuum snarere enn som distinkte fibertyper.6 Til tross for dette er feltet fortsatt sterkt avhengig av MYH som den primære klassifikatoren for myofiberklassifisering, et syn som sannsynligvis er påvirket av begrensningene og betydelige skjevheter i tidlige gnagerstudier hvis MYH-uttrykksprofiler og utvalg av fibertyper avviker fra de hos mennesker.2 Situasjonen kompliseres ytterligere av det faktum at forskjellige menneskelige skjelettmuskler viser et mangfoldig utvalg av fibertyper.7 Den vastus lateralis er en blandet muskel med en middels (og derfor representativ) MYH-ekspresjonsprofil.7 Dessuten gjør den enkle prøvetakingen den til den best studerte muskelen hos mennesker.
Dermed er objektiv undersøkelse av mangfoldet i skjelettmuskulaturfibre ved hjelp av kraftige «omikk»-verktøy kritisk, men også utfordrende, delvis på grunn av den flerkjernede naturen til skjelettmuskulaturfibre. Imidlertid har transkriptomikk8,9 og proteomikk10-teknologier gjennomgått en revolusjon i sensitivitet de siste årene på grunn av ulike teknologiske fremskritt, noe som muliggjør analyse av skjelettmuskulatur med enkeltfiberoppløsning. Som et resultat har det blitt gjort betydelige fremskritt i karakteriseringen av mangfoldet i enkeltfibre og deres respons på atrofiske stimuli og aldring11,12,13,14,15,16,17,18. Det er viktig å merke seg at disse teknologiske fremskrittene har kliniske anvendelser, som muliggjør mer detaljert og presis karakterisering av sykdomsassosiert dysregulering. For eksempel er patofysiologien til nemalinmyopati, en av de vanligste arvelige muskelsykdommene (MIM 605355 og MIM 161800), kompleks og forvirrende.19,20 Derfor kan en bedre karakterisering av dysreguleringen av skjelettmuskulaturfibre føre til betydelige fremskritt i vår forståelse av denne sykdommen.
Vi utviklet metoder for transkriptomisk og proteomisk analyse av enkeltstående skjelettmuskelfibre, manuelt isolert fra humane biopsiprøver, og anvendte dem på tusenvis av fibre. Dette gjorde det mulig for oss å undersøke den cellulære heterogeniteten til menneskelige skjelettmuskelfibre. I løpet av dette arbeidet demonstrerte vi kraften i transkriptomisk og proteomisk fenotyping av muskelfibre, og identifiserte metabolske, ribosomale og cellulære forbindelsesproteiner som viktige kilder til interfibervariabilitet. Videre, ved å bruke denne proteomiske arbeidsflyten, karakteriserte vi den kliniske relevansen av nematodemyopati i enkeltstående skjelettmuskelfibre, noe som avslørte et koordinert skifte mot ikke-oksidative fibre uavhengig av fibertype basert på myocellulær myopati (MYH).
For å undersøke heterogeniteten til menneskelige skjelettmuskelfibre, utviklet vi to arbeidsflyter for å muliggjøre transkriptom- og proteomanalyse av enkeltstående skjelettmuskelfibre (figur 1A og tilleggsfigur 1A). Vi utviklet og optimaliserte flere metodologiske trinn, fra prøvelagring og bevaring av RNA- og proteinintegritet til optimalisering av gjennomstrømning for hver tilnærming. For transkriptomanalyse ble dette oppnådd ved å sette inn prøvespesifikke molekylære strekkoder i det første trinnet av revers transkripsjon, slik at 96 fibre kunne samles for effektiv nedstrøms prosessering. Dypere sekvensering (± 1 million avlesninger per fiber) sammenlignet med tradisjonelle enkeltcelletilnærminger beriket transkriptomdataene ytterligere.21 For proteomikk brukte vi en kort kromatografisk gradient (21 minutter) kombinert med DIA-PASEF-datainnsamling på et timsTOF massespektrometer for å optimalisere proteomdybden samtidig som vi opprettholdt høy gjennomstrømning. 22,23 For å undersøke heterogeniteten til friske skjelettmuskelfibre, karakteriserte vi transkriptomene til 1050 individuelle fibre fra 14 friske voksne donorer og proteomene til 1038 fibre fra 5 friske voksne donorer (Tilleggstabell 1). I denne artikkelen omtales disse datasettene som henholdsvis 1000-fibers transkriptomer og proteomer. Vår tilnærming oppdaget totalt 27 237 transkripter og 2983 proteiner i de transkriptomiske og proteomiske analysene på 1000 fibre (figur 1A, tilleggsdatasett 1–2). Etter å ha filtrert de transkriptomiske og proteomiske datasettene for >1000 oppdagede gener og 50 % gyldige verdier per fiber, ble påfølgende bioinformatiske analyser utført for henholdsvis 925 og 974 fibre i transkriptomet og proteomet. Etter filtrering ble det påvist et gjennomsnitt på 4257 ± 1557 gener og 2015 ± 234 proteiner (gjennomsnitt ± SD) per fiber, med begrenset variasjon mellom individer (Tilleggsfigur 1B–C, Tilleggsdatasett 3–4). Imidlertid var variasjonen innenfor forsøkspersonene mer uttalt på tvers av deltakerne, sannsynligvis på grunn av forskjeller i RNA/proteinutbytte mellom fibre med ulik lengde og tverrsnittsareal. For de fleste proteiner (>2000) var variasjonskoeffisienten under 20 % (Tilleggsfigur 1D). Begge metodene tillot å fange et bredt dynamisk område av transkripter og proteiner med høyt uttrykte signaturer som er viktige for muskelkontraksjon (f.eks. ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (Tilleggsfigur 1E–F). De fleste av de identifiserte trekkene var felles mellom de transkriptomiske og proteomiske datasettene (Tilleggsfigur 1G), og de gjennomsnittlige UMI/LFQ-intensitetene for disse trekkene var rimelig godt korrelert (r = 0,52) (Tilleggsfigur 1H).
Arbeidsflyt for transkriptomikk og proteomikk (opprettet med BioRender.com). BD dynamiske områdekurver for MYH7, MYH2 og MYH1, og beregnede terskler for fibertypetildeling. E, F Fordeling av MYH-ekspresjon på tvers av fibre i transkriptomikk- og proteomikkdatasett. G, H Uniform Diversity Approximation and Projection (UMAP)-plott for transkriptomikk og proteomikk farget etter MYH-basert fibertype. I, J Funksjonsplott som viser MYH7-, MYH2- og MYH1-ekspresjon i transkriptomikk- og proteomikkdatasett.
Vi satte oss først fore å tilordne MYH-basert fibertype til hver fiber ved hjelp av en optimalisert tilnærming som utnytter den høye følsomheten og det dynamiske området for MYH-ekspresjon i omics-datasett. Tidligere studier har brukt vilkårlige terskler for å merke fibre som ren type 1, type 2A, type 2X eller blandet basert på en fast prosentandel av ekspresjon av forskjellige MYH-er11,14,24. Vi brukte en annen tilnærming der ekspresjonen av hver fiber ble rangert etter MYH-ene vi brukte til å type fibrene: MYH7, MYH2 og MYH1, som tilsvarer henholdsvis type 1-, type 2A- og type 2X-fibre. Vi beregnet deretter matematisk det nedre vendepunktet for hver resulterende kurve og brukte det som en terskel for å tilordne fibre som positive (over terskelen) eller negative (under terskelen) for hver MYH (figur 1B–D). Disse dataene viser at MYH7 (figur 1B) og MYH2 (figur 1C) har mer distinkte av/på-ekspresjonsprofiler på RNA-nivå sammenlignet med proteinnivå. På proteinnivå var det faktisk svært få fibre som ikke uttrykte MYH7, og ingen fibre hadde 100 % MYH2-ekspresjon. Deretter brukte vi forhåndsbestemte ekspresjonsterskler for å tilordne MYH-baserte fibertyper til alle fibrene i hvert datasett. For eksempel ble MYH7+/MYH2-/MYH1- fibre tilordnet type 1, mens MYH7-/MYH2+/MYH1+ fibre ble tilordnet blandet type 2A/2X (se tilleggstabell 2 for fullstendig beskrivelse). Ved å samle alle fibrene observerte vi en bemerkelsesverdig lik fordeling av MYH-baserte fibertyper på både RNA-nivå (figur 1E) og proteinnivå (figur 1F), mens den relative sammensetningen av MYH-baserte fibertyper varierte mellom individer, som forventet (tilleggsfigur 2A). De fleste fibrene ble klassifisert som enten ren type 1 (34–35 %) eller type 2A (36–38 %), selv om et betydelig antall blandede type 2A/2X-fibre også ble påvist (16–19 %). En slående forskjell er at rene type 2X-fibre bare kunne detekteres på RNA-nivå, men ikke på proteinnivå, noe som tyder på at rask MYH-ekspresjon i det minste delvis er regulert post-transkripsjonelt.
Vi validerte vår proteomikkbaserte MYH-fibertypingsmetode ved bruk av antistoffbasert dot blotting, og begge metodene oppnådde 100 % samsvar i identifiseringen av rene type 1- og type 2A-fibre (se tilleggsfigur 2B). Den proteomikkbaserte tilnærmingen var imidlertid mer sensitiv og mer effektiv i å identifisere blandede fibre og kvantifisere andelen av hvert MYH-gen i hver fiber. Disse dataene demonstrerer effektiviteten av å bruke en objektiv, svært sensitiv omikkbasert tilnærming for å karakterisere skjelettmuskelfibertyper.
Deretter brukte vi den kombinerte informasjonen fra transkriptomikk og proteomikk til å objektivt klassifisere myofibre basert på deres komplette transkriptom eller proteom. Ved å bruke UMAP-metoden (uniform manifold approximation and projection) for å redusere dimensjonaliteten til seks hovedkomponenter (tilleggsfigur 3A–B), var vi i stand til å visualisere myofibervariabilitet i transkriptomet (figur 1G) og proteomet (figur 1H). Det er verdt å merke seg at myofibre ikke ble gruppert etter deltakere (tilleggsfigur 3C–D) eller testdager (tilleggsfigur 3E) i verken transkriptomikk- eller proteomikk-datasettene, noe som tyder på at variasjonen i skjelettmuskelfibre innen forsøkspersonene er høyere enn variasjonen mellom forsøkspersonene. I UMAP-plottet dukket det opp to distinkte klynger som representerer "raske" og "langsomme" myofibre (figur 1G–H). MYH7+ (langsomme) myofibre var gruppert ved den positive polen til UMAP1, mens MYH2+ og MYH1+ (raske) myofibre var gruppert ved den negative polen til UMAP1 (figur 1I–J). Det ble imidlertid ikke skilt mellom fibertyper med rask rykning (dvs. type 2A, type 2X eller blandet 2A/2X) basert på MYH-ekspresjon, noe som tyder på at MYH1-ekspresjon (figur 1I–J) eller andre klassiske 2X myofibermarkører som ACTN3- eller MYLK2-ekspresjon (tilleggsfigurer 4A–B) ikke skiller mellom forskjellige myofibertyper når man vurderer hele transkriptomet eller proteomet. Sammenlignet med MYH2 og MYH7 var det dessuten få transkripter eller proteiner som var positivt korrelert med MYH1 (tilleggsfigurer 4C–H), noe som tyder på at MYH1-forekomsten ikke fullt ut gjenspeiler myofibertranskriptomet/proteomet. Lignende konklusjoner ble nådd ved vurdering av den blandede ekspresjonen av de tre MYH-isoformene på UMAP-nivå (tilleggsfigurer 4I–J). Selv om 2X-fibre kan identifiseres på transkriptnivå basert på MYH-kvantifisering alene, kan ikke MYH1+-fibre skilles fra andre raske fibre når man vurderer hele transkriptomet eller proteomet.
Som en innledende undersøkelse av heterogenitet i langsomme fibre utover MYH, vurderte vi fire etablerte proteiner spesifikt for langsomme fibre: TPM3, TNNT1, MYL3 og ATP2A22. Subtyper av langsomme fibre viste høye, men ikke perfekte, Pearson-korrelasjoner med MYH7 i både transkriptomikk (tilleggsfigur 5A) og proteomikk (tilleggsfigur 5B). Omtrent 25 % og 33 % av de langsomme fibrene ble ikke klassifisert som rene langsomme fibre av alle gen-/protein-subtyper i henholdsvis transkriptomikk (tilleggsfigur 5C) og proteomikk (tilleggsfigur 5D). Derfor introduserer klassifisering av langsomme fibre basert på flere gen-/protein-subtyper ytterligere kompleksitet, selv for proteiner som er kjent for å være fibertypespesifikke. Dette antyder at fiberklassifisering basert på isoformer av en enkelt gen-/proteinfamilie kanskje ikke gjenspeiler den sanne heterogeniteten til skjelettmuskelfibre på en tilstrekkelig måte.
For å utforske den fenotypiske variasjonen til menneskelige skjelettmuskelfibre ytterligere på skalaen til hele omics-modellen, utførte vi objektiv dimensjonalitetsreduksjon av dataene ved hjelp av hovedkomponentanalyse (PCA) (figur 2A). I likhet med UMAP-plottene påvirket verken deltaker eller testdag fiberklynging på PCA-nivå (tilleggsfigurer 6A–C). I begge datasettene ble MYH-basert fibertype forklart av PC2, som viste en klynge av langsomme type 1-fibre og en andre klynge som inneholdt raske type 2A-, type 2X- og blandede 2A/2X-fibre (figur 2A). I begge datasettene var disse to klyngene forbundet med et lite antall blandede type 1/2A-fibre. Som forventet bekreftet overrepresentasjonsanalyse av de viktigste PC-driverne at PC2 var drevet av kontraktile og metabolske signaturer (figur 2B og tilleggsfigurer 6D–E, tilleggsdatasett 5–6). Totalt sett ble MYH-basert fibertype funnet å være tilstrekkelig til å forklare kontinuerlig variasjon langs PC2, med unntak av såkalte 2X-fibre som var fordelt over hele transkriptomet i den raske klyngen.
A. Principal component analysis (PCA) plott av transkriptom- og proteomdatasett farget i henhold til fibertype basert på MYH. B. Berikelsesanalyse av transkript- og proteindrivere i PC2 og PC1. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av clusterProfiler-pakken og Benjamini-Hochberg-justerte p-verdier. C, D. PCA-plott farget i henhold til intercellulære adhesjonsgenontologi (GO)-termer i transkriptomet og costamere GO-termer i proteomet. Piler representerer transkript- og proteindrivere og deres retninger. E, F. Uniform manifold approksimasjon og projeksjon (UMAP) plott av klinisk relevante trekk som viser uttrykksgradienter uavhengig av langsom/rask fibertype. G, H. Korrelasjoner mellom PC2- og PC1-drivere i transkriptomer og proteomer.
Uventet nok forklarte MYH-basert myofibertype bare den nest høyeste graden av variasjon (PC2), noe som tyder på at andre biologiske faktorer som ikke er relatert til MYH-basert myofibertype (PC1) spiller en viktig rolle i reguleringen av heterogenitet i skjelettmuskulaturfibre. Overrepresentasjonsanalyse av de viktigste driverne i PC1 viste at variasjonen i PC1 primært ble bestemt av celle-celle-adhesjon og ribosominnhold i transkriptomet, og kostamerer og ribosomale proteiner i proteomet (figur 2B og tilleggsfigurer 6D–E, tilleggsdatasett 7). I skjelettmuskulatur forbinder kostamerer Z-skiven med sarkolemma og er involvert i kraftoverføring og signalering. 25 Annoterte PCA-plott ved bruk av celle-celle-adhesjon (transkriptom, figur 2C) og kostamer (proteom, figur 2D)-trekk viste et sterkt venstreforskyvning i PC1, noe som indikerer at disse trekkene er beriket i visse fibre.
En mer detaljert undersøkelse av myofiberklynger på UMAP-nivå viste at de fleste trekkene viste en myofibertypeuavhengig MYH-basert uttrykksgradient snarere enn myofiber-subklyngespesifikk. Denne kontinuiteten ble observert for flere gener assosiert med patologiske tilstander (figur 2E), slik som CHCHD10 (nevromuskulær sykdom), SLIT3 (muskelatrofi), CTDNEP1 (muskelsykdom). Denne kontinuiteten ble også observert på tvers av proteomet, inkludert proteiner assosiert med nevrologiske lidelser (UGDH), insulinsignalering (PHIP) og transkripsjon (HIST1H2AB) (figur 2F). Samlet sett indikerer disse dataene kontinuitet i fibertypeuavhengig langsom/rask rykningsheterogenitet på tvers av forskjellige myofibre.
Interessant nok viste drivergener i PC2 god transkriptom-proteom-korrelasjon (r = 0,663) (figur 2G), noe som tyder på at fibertyper med langsom og rask rykning, og spesielt de kontraktile og metabolske egenskapene til skjelettmuskelfibre, er transkripsjonelt regulert. Drivergener i PC1 viste imidlertid ingen transkriptom-proteom-korrelasjon (r = -0,027) (figur 2H), noe som tyder på at variasjoner som ikke er relatert til fibertyper med langsom/rask rykning, i stor grad er regulert post-transkripsjonelt. Fordi variasjoner i PC1 primært ble forklart av ribosomale genontologiske termer, og gitt at ribosomer spiller en avgjørende og spesialisert rolle i cellen ved å aktivt delta i og påvirke proteintranslasjon,31 satte vi oss deretter fore å undersøke denne uventede ribosomale heterogeniteten.
Vi farget først plottet for proteomikk-hovedkomponentanalyse i henhold til den relative mengden proteiner i GOCC-termen «cytoplasmatisk ribosom» (figur 3A). Selv om denne termen er anriket på den positive siden av PC1, noe som resulterer i en liten gradient, driver ribosomale proteiner partisjonering i begge retninger av PC1 (figur 3A). Ribosomale proteiner anriket på den negative siden av PC1 inkluderte RPL18, RPS18 og RPS13 (figur 3B), mens RPL31, RPL35 og RPL38 (figur 3C) var hoveddriverne på den positive siden av PC1. Interessant nok var RPL38 og RPS13 høyt uttrykt i skjelettmuskulatur sammenlignet med andre vev (tilleggsfigur 7A). Disse særegne ribosomale signaturene i PC1 ble ikke observert i transkriptomet (tilleggsfigur 7B), noe som indikerer post-transkripsjonell regulering.
A. Principal component analysis (PCA) plott farget i henhold til cytoplasmatiske ribosomale genontologi (GO) termer på tvers av proteomet. Piler indikerer retningen på proteinmediert variasjon i PCA-plottet. Linjelengden tilsvarer prinsipal component score for et gitt protein. B, C. PCA-funksjonsplott for RPS13 og RPL38. D. Uovervåket hierarkisk klyngeanalyse av cytoplasmatiske ribosomale proteiner. E. Strukturell modell av 80S ribosomet (PDB: 4V6X) som fremhever ribosomale proteiner med ulik forekomst i skjelettmuskelfibre. F. Ribosomale proteiner med ulik støkiometri lokalisert nær mRNA-utgangskanalen.
Konseptene ribosomal heterogenitet og spesialisering har blitt foreslått tidligere, hvor tilstedeværelsen av distinkte ribosom-subpopulasjoner (ribosomal heterogenitet) direkte kan påvirke proteintranslasjon i forskjellige vev32 og celler33 gjennom selektiv translasjon av spesifikke mRNA-transkriptbassenger34 (ribosomspesialisering). For å identifisere subpopulasjoner av ribosomale proteiner som er kouttrykt i skjelettmuskelfibre, utførte vi en uovervåket hierarkisk klyngeanalyse av ribosomale proteiner i proteomet (figur 3D, tilleggsdatasett 8). Som forventet klynget ikke ribosomale proteiner seg etter fibertype basert på MYH. Vi identifiserte imidlertid tre distinkte klynger av ribosomale proteiner; den første klyngen (ribosomal_cluster_1) er koregulert med RPL38 og har dermed økt uttrykk i fibre med en positiv PC1-profil. Den andre klyngen (ribosomal_cluster_2) er koregulert med RPS13 og er forhøyet i fibre med en negativ PC1-profil. Den tredje klyngen (ribosomal_klynge_3) viser ikke koordinert differensiell uttrykk i skjelettmuskelfibre og kan betraktes som det "kjerne" ribosomale proteinet i skjelettmuskulaturen. Både ribosomalklynge 1 og 2 inneholder ribosomale proteiner som tidligere har vist seg å regulere alternativ translasjon (f.eks. RPL10A, RPL38, RPS19 og RPS25) og funksjonelt påvirke utviklingen (f.eks. RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 I samsvar med PCA-resultatene viste den observerte heterogene representasjonen av disse ribosomale proteinene på tvers av fibrene også kontinuitet (tilleggsfigur 7C).
For å visualisere plasseringen av heterogene ribosomale proteiner i ribosomet, brukte vi en strukturell modell av det humane 80S-ribosomet (Protein Data Bank: 4V6X) (figur 3E). Etter å ha isolert ribosomale proteiner som tilhørte forskjellige ribosomale klynger, var plasseringene deres ikke tett justert, noe som tyder på at vår tilnærming ikke klarte å gi berikelse for visse regioner/fraksjoner av ribosomet. Interessant nok var imidlertid andelen store subenhetsproteiner i klynge 2 lavere enn i klynger 1 og 3 (tilleggsfigur 7D). Vi observerte at proteiner med endret støkiometri i skjelettmuskelfibre hovedsakelig var lokalisert til ribosomoverflaten (figur 3E), i samsvar med deres evne til å samhandle med interne ribosominngangssteder (IRES)-elementer i forskjellige mRNA-populasjoner, og dermed koordinere selektiv translasjon. 40, 41 Videre var mange proteiner med endret støkiometri i skjelettmuskelfibre lokalisert i nærheten av funksjonelle regioner som mRNA-utgangstunnelen (figur 3F), som selektivt regulerer translasjonsforlengelse og arrest av spesifikke peptider. 42 Oppsummert tyder dataene våre på at støkiometrien til ribosomale proteiner i skjelettmuskulatur viser heterogenitet, noe som resulterer i forskjeller mellom skjelettmuskelfibre.
Vi satte oss deretter fore å identifisere signaturer av raske og langsomme fibre og utforske mekanismene bak deres transkripsjonsregulering. Ved å sammenligne de raske og langsomme fiberklyngene definert av UMAP i de to datasettene (figur 1G–H og 4A–B), identifiserte transkriptomiske og proteomiske analyser henholdsvis 1366 og 804 ulikt forekommende egenskaper (figur 4A–B, tilleggsdatasett 9–12). Vi observerte de forventede forskjellene i signaturer relatert til sarkomerer (f.eks. tropomyosin og troponin), eksitasjon-kontraksjonskobling (SERCA-isoformer) og energimetabolisme (f.eks. ALDOA og CKB). Dessuten ble transkripter og proteiner som regulerer proteinubikvitinering ulikt uttrykt i raske og langsomme fibre (f.eks. USP54, SH3RF2, USP28 og USP48) (figur 4A–B). Dessuten var det mikrobielle proteingenet RP11-451G4.2 (DWORF), som tidligere har vist seg å være differensielt uttrykt på tvers av lammemuskelfibertyper43 og forsterker SERCA-aktivitet i hjertemuskel44, signifikant oppregulert i langsomme skjelettmuskelfibre (figur 4A). På samme måte ble det på individuelt fibernivå observert signifikante forskjeller i kjente signaturer som metabolismerelaterte laktatdehydrogenase-isoformer (LDHA og LDHB, figur 4C og tilleggsfigur 8A)45,46 samt tidligere ukjente fibertypespesifikke signaturer (som IRX3, USP54, USP28 og DPYSL3) (figur 4C). Det var en betydelig overlapping av differensielt uttrykte trekk mellom de transkriptomiske og proteomiske datasettene (tilleggsfigur 8B), samt en korrelasjon mellom foldingendring drevet hovedsakelig av den mer uttalte differensielle uttrykkelsen av sarkomerfunksjoner (tilleggsfigur 8C). Det er verdt å merke seg at noen signaturer (f.eks. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) viste sterk post-transkripsjonell regulering bare på proteomisk nivå og hadde langsomme/hurtige rykningsfiberspesifikke uttrykksprofiler (tilleggsfigur 8C).
A- og B-vulkanplott som sammenligner langsomme og raske klynger identifisert av UMAP-plottene (uniform manifold approximation and projection) i figur 1G–H. Fargede prikker representerer transkripter eller proteiner som er signifikant forskjellige ved FDR < 0,05, og mørkere prikker representerer transkripter eller proteiner som er signifikant forskjellige ved logaritmisk endring > 1. Toveis statistisk analyse ble utført ved hjelp av DESeq2 Wald-testen med Benjamini-Hochberg-justerte p-verdier (transkriptomikk) eller Limma lineær modellmetode med empirisk Bayesiansk analyse etterfulgt av Benjamini-Hochberg-justering for multiple sammenligninger (proteomikk). C. Signaturplott av utvalgte differensielt uttrykte gener eller proteiner mellom langsomme og raske fibre. D. Berikelsesanalyse av signifikant differensielt uttrykte transkripter og proteiner. Overlappende verdier er beriket i begge datasettene, transkriptomverdier er beriket bare i transkriptomet, og proteomverdier er beriket bare i proteomet. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av clusterProfiler-pakken med Benjamini-Hochberg-justerte p-verdier. E. Fibertypespesifikke transkripsjonsfaktorer identifisert av SCENIC basert på SCENIC-avledede regulatorspesifisitetspoeng og differensiell mRNA-ekspresjon mellom fibertyper. F. Profilering av utvalgte transkripsjonsfaktorer som uttrykkes differensielt mellom langsomme og raske fibre.
Deretter utførte vi en overrepresentasjonsanalyse av differensielt representerte gener og proteiner (figur 4D, supplerende datasett 13). Berikelse av signalveier for funksjoner som var forskjellige mellom de to datasettene avdekket forventede forskjeller, som fettsyre-β-oksidasjon og ketonmetabolismeprosesser (langsomme fibre), myofilament-/muskelkontraksjon (henholdsvis raske og langsomme fibre) og karbohydratkatabolske prosesser (raske fibre). Serin/treonin-proteinfosfataseaktivitet var også forhøyet i raske fibre, drevet av funksjoner som de regulatoriske og katalytiske fosfatase-underenhetene (PPP3CB, PPP1R3D og PPP1R3A), som er kjent for å regulere glykogenmetabolismen (47) (tilleggsfigurer 8D–E). Andre signalveier beriket med raske fibre inkluderte prosesseringslegemer (P-) (YTHDF3, TRIM21, LSM2) i proteomet (tilleggsfigur 8F), potensielt involvert i post-transkripsjonell regulering (48), og transkripsjonsfaktoraktivitet (SREBF1, RXRG, RORA) i transkriptomet (tilleggsfigur 8G). Langsomme fibre var beriket med oksidoreduktaseaktivitet (BDH1, DCXR, TXN2) (tilleggsfigur 8H), amidbinding (CPTP, PFDN2, CRYAB) (tilleggsfigur 8I), ekstracellulær matriks (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (tilleggsfigur 8J) og reseptor-ligandaktivitet (FNDC5, SPX, NENF) (tilleggsfigur 8K).
For å få ytterligere innsikt i den transkripsjonelle reguleringen som ligger til grunn for langsomme/raske muskelfibertyper, utførte vi en analyse av transkripsjonsfaktorberikelse ved hjelp av SCENIC49 (Supplerende datasett 14). Mange transkripsjonsfaktorer var signifikant beriket mellom raske og langsomme muskelfibre (figur 4E). Dette inkluderte transkripsjonsfaktorer som MAFA, som tidligere har vært knyttet til rask muskelfiberutvikling,50 samt flere transkripsjonsfaktorer som ikke tidligere har vært assosiert med genprogrammer spesifikke for muskelfibertyper. Blant disse var PITX1, EGR1 og MYF6 de mest berikede transkripsjonsfaktorene i raske muskelfibre (figur 4E). I motsetning til dette var ZSCAN30 og EPAS1 (også kjent som HIF2A) de mest berikede transkripsjonsfaktorene i langsomme muskelfibre (figur 4E). I samsvar med dette ble MAFA uttrykt på høyere nivåer i UMAP-regionen som korresponderer med raske muskelfibre, mens EPAS1 hadde det motsatte uttrykksmønsteret (figur 4F).
I tillegg til kjente proteinkodende gener, finnes det en rekke ikke-kodende RNA-biotyper som kan være involvert i reguleringen av menneskelig utvikling og sykdom. 51, 52 I transkriptomdatasett viser flere ikke-kodende RNA-er fibertypespesifisitet (figur 5A og tilleggsdatasett 15), inkludert LINC01405, som er svært spesifikk for langsomme fibre og rapporteres å være redusert i muskel fra pasienter med mitokondriell myopati. 53 I motsetning til dette viser RP11-255P5.3, som tilsvarer lnc-ERCC5-5-genet (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, rask fibertypespesifisitet. Både LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) og RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) viser skjelettmuskelspesifisitet (tilleggsfigur 9A–B) og har ingen kjente kontraktile gener innenfor sitt 1 Mb genomiske nabolag, noe som tyder på at de spiller en spesialisert rolle i reguleringen av fibertyper snarere enn å regulere nærliggende kontraktile gener. De langsomme/raske fibertypespesifikke uttrykkprofilene til henholdsvis LINC01405 og RP11-255P5.3 ble bekreftet ved hjelp av RNAscope (figur 5B–C).
A. Ikke-kodende RNA-transkripter er signifikant regulert i langsomme og raske muskelfibre. B. Representative RNAscope-bilder som viser henholdsvis LINC01405 og RP11-255P5.3 sine langsomme og raske fibertyper. Skala = 50 μm. C. Kvantifisering av myofibertypespesifikk ikke-kodende RNA-ekspresjon bestemt av RNAscope (n = 3 biopsier fra uavhengige individer, som sammenligner raske og langsomme muskelfibre i hvert individ). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av en tosidig Student's t-test. Boksplott viser medianen og første og tredje kvartil, med værhår som peker på minimums- og maksimumsverdiene. D. De novo arbeidsflyt for identifisering av mikrobielle proteiner (opprettet med BioRender.com). E. Det mikrobielle proteinet LINC01405_ORF408:17441:17358 uttrykkes spesifikt i langsomme skjelettmuskelfibre (n = 5 biopsier fra uavhengige deltakere, som sammenligner raske og langsomme muskelfibre i hver deltaker). Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Limms lineære modellmetode kombinert med en empirisk Bayesiansk tilnærming, etterfulgt av Benjamini-Hochberg-metoden for multiple sammenligninger med p-verdijustering. Boksplott viser median, første og tredje kvartil, med værhår som peker mot maksimums-/minimumsverdiene.
Nylig har studier vist at mange antatte ikke-kodende transkripter koder for transkriberte mikrobielle proteiner, hvorav noen regulerer muskelfunksjon. 44, 55 For å identifisere mikrobielle proteiner med potensiell fibertypespesifisitet, søkte vi i vårt 1000-fiberproteomdatasett ved hjelp av en tilpasset FASTA-fil som inneholder sekvensene av ikke-kodende transkripter (n = 305) funnet i 1000-fibertranskriptomdatasettet (figur 5D). Vi identifiserte 197 mikrobielle proteiner fra 22 forskjellige transkripter, hvorav 71 var differensielt regulert mellom langsomme og raske skjelettmuskelfibre (tilleggsfigur 9C og tilleggsdatasett 16). For LINC01405 ble tre mikrobielle proteinprodukter identifisert, hvorav ett viste lignende langsom fiberspesifisitet som transkriptet (figur 5E og tilleggsfigur 9D). Dermed identifiserte vi LINC01405 som et gen som koder for et mikrobielt protein spesifikt for langsomme skjelettmuskelfibre.
Vi utviklet en omfattende arbeidsflyt for storskala proteomisk karakterisering av individuelle muskelfibre og identifiserte regulatorer av fiberheterogenitet hos friske tilstander. Vi brukte denne arbeidsflyten for å forstå hvordan nemaline myopatier påvirker heterogeniteten i skjelettmuskelfibre. Nemaline myopatier er arvelige muskelsykdommer som forårsaker muskelsvakhet, og som hos berørte barn presenterer seg med en rekke komplikasjoner, inkludert pustevansker, skoliose og begrenset mobilitet i lemmene.19,20 Vanligvis resulterer patogene varianter i gener som aktin alfa 1 (ACTA1) i nemaline myopatier i en overvekt av langsom fibermyofibersammensetning, selv om denne effekten er heterogen. Et bemerkelsesverdig unntak er troponin T1 nemaline myopati (TNNT1), som har en overvekt av raske fibre. Dermed kan en bedre forståelse av heterogeniteten som ligger til grunn for skjelettmuskelfiberdysreguleringen observert i nemaline myopatier bidra til å avdekke det komplekse forholdet mellom disse sykdommene og myofibertypen.
Sammenlignet med friske kontrollpersoner (n=3 per gruppe) viste myofibre isolert fra pasienter med nemalin myopati med mutasjoner i ACTA1- og TNNT1-genene markert myofiberatrofi eller -dystrofi (figur 6A, tilleggstabell 3). Dette ga betydelige tekniske utfordringer for proteomisk analyse på grunn av den begrensede mengden tilgjengelig materiale. Til tross for dette var vi i stand til å oppdage 2485 proteiner i 272 skjelettmyofibre. Etter filtrering for minst 1000 kvantifiserte proteiner per fiber, ble 250 fibre utsatt for påfølgende bioinformatisk analyse. Etter filtrering ble et gjennomsnitt på 1573 ± 359 proteiner per fiber kvantifisert (tilleggsfigur 10A, tilleggsdatasett 17–18). Det er verdt å merke seg at til tross for den betydelige reduksjonen i fiberstørrelse, ble proteomdybden i pasientprøvene med nemalin myopati bare beskjedent redusert. Videre tillot behandlingen av disse dataene ved hjelp av våre egne FASTA-filer (inkludert ikke-kodende transkripter) oss å identifisere fem mikrobielle proteiner i skjelettmyofibre fra pasienter med nemalinmyopati (tilleggsdatasett 19). Det dynamiske området til proteomet var betydelig bredere, og totale proteiner i kontrollgruppen korrelerte godt med resultatene fra en tidligere proteomanalyse med 1000 fibre (tilleggsfigur 10B–C).
A. Mikroskopiske bilder som viser fiberatrofi eller dystrofi og overvekt av forskjellige fibertyper basert på MYH i ACTA1- og TNNT1-nemaline myopatier (NM). Skala = 100 μm. For å sikre reproduserbarhet av farging hos ACTA1- og TNNT1-pasienter ble tre pasientbiopsier farget to til tre ganger (fire snitt per tilfelle) før representative bilder ble valgt. B. Fibertypeforhold hos deltakere basert på MYH. C. Prinsipal komponentanalyse (PCA)-plott av skjelettmuskelfibre hos pasienter med nemaline myopatier og kontroller. D. Skjelettmuskelfibre fra pasienter med nemaline myopatier og kontroller projisert på et PCA-plott bestemt fra de 1000 fibrene analysert i figur 2. For eksempel vulkanplott som sammenligner forskjeller mellom deltakere med ACTA1- og TNNT1-nemaline myopatier og kontroller, og mellom deltakere med ACTA1- og TNNT1-nemaline myopatier. Fargede sirkler angir proteiner som var signifikant forskjellige ved π < 0,05, og mørke prikker angir proteiner som var signifikant forskjellige ved FDR < 0,05. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av Limma lineær modellmetode og empiriske Bayesianske metoder, etterfulgt av p-verdijustering for multiple sammenligninger ved hjelp av Benjamini-Hochberg-metoden. H. Berikelsesanalyse av signifikant differensielt uttrykte proteiner over hele proteomet og i type 1- og 2A-fibre. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av clusterProfiler-pakken og Benjamini-Hochberg-justerte p-verdier. I, J. Principal component analysis (PCA) plott farget av ekstracellulær matrise og mitokondriell genontologi (GO) termer.
Fordi nemaline myopatier kan påvirke andelen MYH-uttrykkende myofibertyper i skjelettmuskulatur,19,20 undersøkte vi først de MYH-uttrykkende myofibertypene hos pasienter med nemaline myopatier og kontrollpersoner. Vi bestemte myofibertypen ved hjelp av en objektiv metode som tidligere er beskrevet for 1000 myofiber-analysen (tilleggsfigurer 10D–E), og klarte igjen ikke å identifisere rene 2X myofibre (figur 6B). Vi observerte en heterogen effekt av nemaline myopatier på myofibertypen, ettersom to pasienter med ACTA1-mutasjoner hadde en økt andel type 1 myofibre, mens to pasienter med TNNT1 nemaline myopati hadde en redusert andel type 1 myofibre (figur 6B). Ekspresjonen av MYH2 og raske troponin-isoformer (TNNC2, TNNI2 og TNNT3) var faktisk redusert i ACTA1-nemalin myopatier, mens MYH7-ekspresjonen var redusert i TNNT1-nemalin myopatier (tilleggsfigur 11A). Dette er i samsvar med tidligere rapporter om heterogen myofibertypebytte i nemalin myopatier.19,20 Vi bekreftet disse resultatene ved immunhistokjemi og fant at pasienter med ACTA1-nemalin myopati hadde en overvekt av type 1 myofibre, mens pasienter med TNNT1-nemalin myopati hadde det motsatte mønsteret (figur 6A).
På enkeltfiberproteomnivå grupperte skjelettmuskelfibre fra pasienter med ACTA1- og TNNT1-nemalin myopati seg med majoriteten av kontrollfibrene, hvor TNNT1-nemalin myopatifibre generelt var de mest alvorlig påvirkede (figur 6C). Dette var spesielt tydelig når man plottet PCA-plott (principal component analysis) av pseudo-oppblåste fibre for hver pasient, hvor TNNT1-nemalin myopatipasient 2 og 3 fremstod som de som var lengst unna kontrollprøvene (tilleggsfigur 11B, tilleggsdatasett 20). For å bedre forstå hvordan fibre fra myopatipasienter sammenlignes med friske fibre, brukte vi detaljert informasjon hentet fra proteomisk analyse av 1000 fibre fra friske voksne deltakere. Vi projiserte fibre fra myopatidatasettet (ACTA1- og TNNT1-nemalin myopatipasienter og kontroller) på PCA-plottet hentet fra den proteomiske analysen med 1000 fibre (figur 6D). Fordelingen av MYH-fibertyper langs PC2 i kontrollfibrene var lik fiberfordelingen oppnådd fra den proteomiske analysen av 1000 fibre. Imidlertid forskjøv de fleste fibrene hos pasienter med nemalin myopati seg nedover PC2, og overlappet med friske hurtigrykkende fibre, uavhengig av deres native MYH-fibertype. Selv om pasienter med ACTA1 nemalin myopati viste et skifte mot type 1-fibre når de ble kvantifisert ved hjelp av MYH-baserte metoder, forskjøv både ACTA1 nemalin myopati og TNNT1 nemalin myopati skjelettmuskelfiberproteomet mot hurtigrykkende fibre.
Vi sammenlignet deretter hver pasientgruppe direkte med friske kontrollpersoner og identifiserte henholdsvis 256 og 552 differensielt uttrykte proteiner i ACTA1- og TNNT1-nemalinmyopatier (figur 6E–G og tilleggsfigur 11C, tilleggsdatasett 21). Genanrikningsanalyse avdekket en koordinert reduksjon i mitokondrielle proteiner (figur 6H–I, tilleggsdatasett 22). Overraskende nok, til tross for den differensielle overvekten av fibertyper i ACTA1- og TNNT1-nemalinmyopatier, var denne reduksjonen helt uavhengig av den MYH-baserte fibertypen (figur 6H og tilleggsfigur 11D–I, tilleggsdatasett 23). Tre mikrobielle proteiner ble også regulert i ACTA1- eller TNNT1-nemalinmyopatier. To av disse mikroproteinene, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (også kjent som LINC00598 eller Lnc-FOXO1) og ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), viste kun ulik forekomst i type 1-myofibre. Det er tidligere rapportert at ENSG00000215483_TR14_ORF67 spiller en rolle i regulering av cellesyklus.56 På den annen side var ENSG00000232046_TR1_ORF437 (tilsvarende LINC01798) økt i både type 1- og type 2A-myofibre i ACTA1-nemalin myopati sammenlignet med friske kontrollpersoner (tilleggsfigur 12A, tilleggsdatasett 24). I motsetning til dette var ribosomale proteiner i stor grad upåvirket av nemalinmyopati, selv om RPS17 var nedregulert i ACTA1 nemalinmyopati (fig. 6E).
Anrikningsanalyse avdekket også oppregulering av immunsystemprosesser i ACTA1- og TNNT1-nemalinmyopatier, mens celleadhesjon også var økt i TNNT1-nemalinmyopati (figur 6H). Anrikningen av disse ekstracellulære faktorene ble reflektert av de ekstracellulære matriksproteinene som forskjøv PCA i PC1 og PC2 i en negativ retning (dvs. mot de mest berørte fibrene) (figur 6J). Begge pasientgruppene viste økt uttrykk av ekstracellulære proteiner involvert i immunresponser og sarkolemmale reparasjonsmekanismer, slik som anneksiner (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 og deres interagerende protein S100A1159 (tilleggsfigurer 12B–C). Denne prosessen har tidligere blitt rapportert å være forsterket i muskeldystrofier60, men så vidt vi vet har den ikke tidligere vært assosiert med nemaline myopatier. Normal funksjon av dette molekylære maskineriet er nødvendig for sarkolemmal reparasjon etter skade og for fusjon av nydannede myocytter med myofibre58,61. Dermed antyder den økte aktiviteten i denne prosessen i begge pasientgruppene en reparativ respons på skade forårsaket av myofiberinstabilitet.
Effektene av hver nemalinmyopati var godt korrelert (r = 0,736) og viste rimelig overlapping (supplerende figur 11A–B), noe som indikerer at ACTA1 og TNNT1 nemalinmyopati har lignende effekter på proteomet. Imidlertid var noen proteiner bare regulert i ACTA1- eller TNNT1 nemalinmyopati (supplerende figur 11A og C). Det profibrotiske proteinet MFAP4 var et av de mest oppregulerte proteinene i TNNT1 nemalinmyopati, men forble uendret i ACTA1 nemalinmyopati. SKIC8, en komponent av PAF1C-komplekset som er ansvarlig for å regulere HOX-gentranskripsjon, var nedregulert i TNNT1 nemalinmyopati, men ikke påvirket i ACTA1 nemalinmyopati (supplerende figur 11A). Direkte sammenligning av ACTA1- og TNNT1-nemalinmyopati avdekket større reduksjoner i mitokondrielle proteiner og økninger i immunsystemproteiner ved TNNT1-nemalinmyopati (figur 6G–H og tilleggsfigurene 11C og 11H–I). Disse dataene stemmer overens med den større atrofien/dystrofien som observeres ved TNNT1-nemalinmyopati sammenlignet med TNNT1-nemalinmyopati (figur 6A), noe som tyder på at TNNT1-nemalinmyopati representerer en mer alvorlig form av sykdommen.
For å vurdere om de observerte effektene av nemalinmyopati vedvarer på helmuskelnivå, utførte vi en bulkproteomisk analyse av muskelbiopsier fra samme kohort av pasienter med TNNT1 nemalinmyopati og sammenlignet dem med kontrollpersoner (n = 3 per gruppe) (Tilleggsfigur 13A, tilleggsdatasett 25). Som forventet var kontrollpersonene nært beslektet i hovedkomponentanalysen, mens pasienter med TNNT1 nemalinmyopati viste høyere intersample-variabilitet, lik den som ble sett i enkeltfiberanalyse (Tilleggsfigur 13B). Bulkanalyse reproduserte de differensielt uttrykte proteinene (Tilleggsfigur 13C, tilleggsdatasett 26) og biologiske prosesser (Tilleggsfigur 13D, tilleggsdatasett 27) fremhevet ved å sammenligne individuelle fibre, men mistet evnen til å skille mellom forskjellige fibertyper og klarte ikke å ta hensyn til heterogene sykdomseffekter på tvers av fibre.
Samlet sett viser disse dataene at proteomikk med enkeltmyofiber kan belyse kliniske biologiske trekk som ikke kan påvises med målrettede metoder som immunoblotting. Dessuten fremhever disse dataene begrensningene ved å bruke aktinfibertyping (MYH) alene for å beskrive fenotypisk tilpasning. Selv om fibertypebytte er forskjellig mellom aktin- og troponin-nemalinmyopatier, frakobler begge nemaline myopatiene MYH-fibertyping fra skjelettmuskelfibermetabolisme mot et raskere og mindre oksidativt muskelproteom.
Cellulær heterogenitet er avgjørende for at vev skal kunne møte deres ulike behov. I skjelettmuskulatur beskrives dette ofte som fibertyper karakterisert ved ulik grad av kraftproduksjon og utmattbarhet. Det er imidlertid klart at dette bare forklarer en liten del av variasjonen i skjelettmuskulaturfibre, som er mye mer variabel, kompleks og mangefasettert enn tidligere antatt. Teknologiske fremskritt har nå kastet lys over faktorene som regulerer skjelettmuskulaturfibre. Faktisk tyder dataene våre på at type 2X-fibre kanskje ikke er en distinkt subtype av skjelettmuskulaturfibre. Videre identifiserte vi metabolske proteiner, ribosomale proteiner og celleassosierte proteiner som viktige determinanter for heterogenitet i skjelettmuskulaturfibre. Ved å anvende vår proteomiske arbeidsflyt på pasientprøver med nematodemyopati, demonstrerte vi videre at MYH-basert fibertyping ikke fullt ut gjenspeiler heterogenitet i skjelettmuskulatur, spesielt når systemet er forstyrret. Faktisk, uavhengig av MYH-basert fibertype, resulterer nematodemyopati i et skifte mot raskere og mindre oksidative fibre.
Skjelettmuskelfibre har blitt klassifisert siden 1800-tallet. Nyere omikkanalyser har gjort det mulig for oss å begynne å forstå uttrykksprofilene til forskjellige MYH-fibertyper og deres responser på forskjellige stimuli. Som beskrevet her, har omikktilnærminger også fordelen av større følsomhet for kvantifisering av fibertypemarkører enn tradisjonelle antistoffbaserte metoder, uten å stole på kvantifisering av en enkelt (eller noen få) markører for å definere en skjelettmuskelfibertype. Vi brukte komplementære transkriptomiske og proteomiske arbeidsflyter og integrerte resultatene for å undersøke transkripsjonell og post-transkripsjonell regulering av fiberheterogenitet i menneskelige skjelettmuskelfibre. Denne arbeidsflyten resulterte i at vi ikke klarte å identifisere rene 2X-type fibre på proteinnivå i vastus lateralis hos vår kohort av friske unge menn. Dette er i samsvar med tidligere enkeltfiberstudier som fant <1 % rene 2X-fibre i frisk vastus lateralis, selv om dette bør bekreftes i andre muskler i fremtiden. Avviket mellom deteksjonen av nesten rene 2X-fibre på mRNA-nivå og bare blandede 2A/2X-fibre på proteinnivå er forvirrende. MYH-isoformens mRNA-ekspresjon er ikke døgnrytmisk,67 noe som tyder på at vi sannsynligvis ikke har «oversett» MYH2-startsignalet i tilsynelatende rene 2X-fibre på RNA-nivå. En mulig forklaring, selv om den er rent hypotetisk, kan være forskjeller i protein- og/eller mRNA-stabilitet mellom MYH-isoformer. Faktisk er ingen raske fibre 100 % rene for noen MYH-isoform, og det er uklart om MYH1 mRNA-ekspresjonsnivåer i området 70–90 % ville resultere i lik MYH1- og MYH2-forekomst på proteinnivå. Når man imidlertid vurderer hele transkriptomet eller proteomet, kan klyngeanalyse med sikkerhet bare identifisere to distinkte klynger som representerer langsomme og raske skjelettmuskelfibre, uavhengig av deres presise MYH-sammensetning. Dette er i samsvar med analyser som bruker transkriptomiske tilnærminger med én kjerne, som vanligvis bare identifiserer to distinkte myonukleære klynger. 68, 69, 70 Selv om tidligere proteomiske studier har identifisert type 2X-fibre, grupperes ikke disse fibrene separat fra resten av de raske fibrene og viser bare et lite antall proteiner med ulik mengde sammenlignet med andre fibertyper basert på MYH. 14 Disse resultatene antyder at vi bør gå tilbake til synet på muskelfiberklassifisering fra tidlig på 1900-tallet, som delte menneskelige skjelettmuskelfibre ikke inn i tre distinkte klasser basert på MYH, men inn i to klynger basert på deres metabolske og kontraktile egenskaper. 63
Enda viktigere er det at myofiberheterogenitet bør vurderes langs flere dimensjoner. Tidligere «omics»-studier har pekt i denne retningen, og antyder at skjelettmuskulaturfibre ikke danner atskilte klynger, men er arrangert langs et kontinuum.11, 13, 14, 64, 71 Her viser vi at myofibre, i tillegg til forskjeller i kontraktile og metabolske egenskaper til skjelettmuskulatur, kan differensieres ved hjelp av trekk relatert til celle-celle-interaksjoner og translasjonsmekanismer. Vi fant faktisk ribosomheterogenitet i skjelettmuskulaturfibre som bidrar til heterogenitet uavhengig av langsomme og raske fibertyper. Den underliggende årsaken til denne betydelige myofiberheterogeniteten, uavhengig av langsomme og raske fibertyper, er fortsatt uklar, men den kan peke på spesialisert romlig organisering i muskelfasikler som optimalt reagerer på spesifikke krefter og belastninger,72 spesialisert cellulær eller organspesifikk kommunikasjon med andre celletyper i muskelmikromiljøet73,74,75 eller forskjeller i ribosomaktivitet innenfor individuelle myofibre. Ribosomal heteroplasmi, enten gjennom paralog substitusjon av RPL3 og RPL3L eller på nivået av 2'O-metylering av rRNA, har faktisk vist seg å være assosiert med skjelettmuskulaturhypertrofi76,77. Multiomiske og romlige anvendelser kombinert med funksjonell karakterisering av individuelle myofibre vil ytterligere forbedre vår forståelse av muskelbiologi på multiomisk nivå78.
Ved å analysere proteomene til enkeltmyofibre fra pasienter med nemaline myopatier, demonstrerte vi også nytten, effektiviteten og anvendbarheten av enkeltmyofiberproteomikk for å belyse den kliniske patofysiologien til skjelettmuskulatur. Ved å sammenligne arbeidsflyten vår med global proteomisk analyse, kunne vi dessuten demonstrere at enkeltmyofiberproteomikk gir samme informasjonsdybde som global vevsproteomikk og utvider denne dybden ved å ta hensyn til interfiberheterogenitet og myofibertype. I tillegg til de forventede (om enn variable) forskjellene i fibertypeforhold observert i ACTA1- og TNNT1 nemaline myopatier sammenlignet med friske kontrollpersoner,19 observerte vi også oksidativ og ekstracellulær ombygging uavhengig av MYH-mediert fibertypebytte. Fibrose har tidligere blitt rapportert ved TNNT1 nemalinmyopatier.19 Vår analyse bygger imidlertid på dette funnet ved også å avsløre økte nivåer av ekstracellulære utskilte stressrelaterte proteiner, som anneksiner, involvert i sarkolemmale reparasjonsmekanismer, i myofibre fra pasienter med ACTA1- og TNNT1 nemalinmyopatier.57,58,59 Avslutningsvis kan økte anneksinnivåer i myofibre fra pasienter med nemalinmyopati representere en cellulær respons på å reparere alvorlig atrofiske myofibre.
Selv om denne studien representerer den største enkeltfiber-helmuskel-omikkanalysen av mennesker til dags dato, er den ikke uten begrensninger. Vi isolerte skjelettmuskelfibre fra et relativt lite og homogent utvalg av deltakere og en enkelt muskel (vastus lateralis). Derfor er det umulig å utelukke eksistensen av spesifikke fiberpopulasjoner på tvers av muskeltyper og i ytterpunktene av muskelfysiologi. For eksempel kan vi ikke utelukke muligheten for at en delmengde av ultraraske fibre (f.eks. rene 2X-fibre) dukker opp hos høyt trente sprintere og/eller styrkeutøvere79 eller i perioder med muskelinaktivitet66,80. Videre forhindret den begrensede utvalgsstørrelsen av deltakere oss fra å undersøke kjønnsforskjeller i fiberheterogenitet, ettersom fibertypeforhold er kjent for å variere mellom menn og kvinner. Videre var vi ikke i stand til å utføre transkriptomiske og proteomiske analyser på de samme muskelfibrene eller prøver fra de samme deltakerne. Etter hvert som vi og andre fortsetter å optimalisere analyser av enkeltceller og enkeltmyofibre ved hjelp av omics-analyse for å oppnå ultra-lav prøveinngang (som demonstrert her i analysen av fibre fra pasienter med mitokondriell myopati), blir muligheten til å kombinere multi-omics (og funksjonelle) tilnærminger innenfor enkeltmuskelfibre tydelig.
Samlet sett identifiserer og forklarer dataene våre transkripsjonelle og posttranskripsjonelle drivere for heterogenitet i skjelettmuskulatur. Mer spesifikt presenterer vi data som utfordrer et langvarig dogme innen skjelettmuskulaturfysiologi knyttet til den klassiske MYH-baserte definisjonen av fibertyper. Vi håper å fornye debatten og til slutt revurdere vår forståelse av klassifisering og heterogenitet av skjelettmuskulaturfibre.
Fjorten kaukasiske deltakere (12 menn og 2 kvinner) samtykket frivillig til å delta i denne studien. Studien ble godkjent av etikkomiteen ved Ghent universitetssykehus (BC-10237), overholdt Helsingforserklæringen fra 2013 og ble registrert på ClinicalTrials.gov (NCT05131555). Deltakernes generelle kjennetegn presenteres i tilleggstabell 1. Etter å ha innhentet muntlig og skriftlig informert samtykke, gjennomgikk deltakerne en medisinsk undersøkelse før de ble endelig inkludert i studien. Deltakerne var unge (22–42 år), friske (ingen medisinske tilstander, ingen røykehistorie) og moderat fysisk aktive. Maksimal oksygenopptak ble bestemt ved hjelp av en steppergometer for å vurdere fysisk form som beskrevet tidligere. 81
Muskelbiopsiprøver ble samlet inn i hvile og fastende tilstand tre ganger, med 14 dagers mellomrom. Fordi disse prøvene ble samlet inn som en del av en større studie, konsumerte deltakerne placebo (laktose), en H1-reseptorantagonist (540 mg fexofenadin) eller en H2-reseptorantagonist (40 mg famotidin) 40 minutter før biopsien. Vi har tidligere vist at disse histaminreseptorantagonistene ikke påvirker hvilende skjelettmuskulaturkondisjon81, og ingen tilstandsrelatert klynging ble observert i våre kvalitetskontrollplott (tilleggsfigur 3 og 6). Et standardisert kosthold (41,4 kcal/kg kroppsvekt, 5,1 g/kg kroppsvekt karbohydrat, 1,4 g/kg kroppsvekt protein og 1,6 g/kg kroppsvekt fett) ble opprettholdt i 48 timer før hver forsøksdag, og en standardisert frokost (1,5 g/kg kroppsvekt karbohydrat) ble inntatt om morgenen på forsøksdagen. Under lokalbedøvelse (0,5 ml 1 % lidokain uten adrenalin) ble det tatt muskelbiopsier fra vastus lateralis-muskelen ved hjelp av perkutan Bergström-aspirasjon.82 Muskelprøver ble umiddelbart innstøpt i RNAlater og lagret ved 4 °C inntil manuell fiberdisseksjon (opptil 3 dager).
Nylig isolerte myofiberbunter ble overført til friskt RNAlater-medium i en kulturskål. Individuelle myofibre ble deretter dissekert manuelt ved hjelp av et stereomikroskop og en fin pinsett. Tjuefem fibre ble dissekert fra hver biopsi, med spesiell oppmerksomhet på å velge fibre fra forskjellige områder av biopsien. Etter disseksjon ble hver fiber forsiktig nedsenket i 3 μl lysisbuffer (SingleShot Cell Lysis Kit, Bio-Rad) som inneholdt proteinase K og DNase-enzymer for å fjerne uønskede proteiner og DNA. Cellelyse og fjerning av protein/DNA ble deretter initiert ved kort virvling, sentrifugering av væsken i en mikrosentrifuge og inkubering ved romtemperatur (10 min). Lysatet ble deretter inkubert i en termisk sykler (T100, Bio-Rad) ved 37 °C i 5 min, 75 °C i 5 min, og deretter umiddelbart lagret ved -80 °C inntil videre prosessering.
Illumina-kompatible polyadenylerte RNA-biblioteker ble fremstilt fra 2 µl myofiberlysat ved bruk av QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq Library Prep Kit (Lexogen). Detaljerte metoder finnes i produsentens håndbok. Prosessen begynner med førstetråds cDNA-syntese ved revers transkripsjon, hvor unike molekylære identifikatorer (UMIs) og prøvespesifikke i1-strekkoder introduseres for å sikre samling av prøver og redusere teknisk variasjon under nedstrøms prosessering. cDNA fra 96 myofibre samles deretter og renses med magnetiske kuler, hvoretter RNA fjernes og andretrådssyntese utføres ved bruk av tilfeldige primere. Biblioteket renses med magnetiske kuler, samlingsspesifikke i5/i7-tagger legges til, og PCR-amplifiseres. Et siste rensetrinn produserer Illumina-kompatible biblioteker. Kvaliteten på hver biblioteksamling ble vurdert ved bruk av High Sensitivity Small Fragment DNA Analysis Kit (Agilent Technologies, DNF-477-0500).
Basert på Qubit-kvantifisering ble poolene ytterligere poolet ved ekvimolare konsentrasjoner (2 nM). Den resulterende poolen ble deretter sekvensert på et NovaSeq 6000-instrument i standardmodus ved bruk av NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nukleotider) med 2 nM belastning (4 % PhiX).
Pipeline-en vår er basert på Lexogens QuantSeq Pool-dataanalysepipeline (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). Dataene ble først demultiplekset med bcl2fastq2 (v2.20.0) basert på i7/i5-indeksen. Read 2 ble deretter demultiplekset med idemux (v0.1.6) basert på i1-prøvestrekkoden, og UMI-sekvenser ble ekstrahert med umi_tools (v1.0.1). Readsene ble deretter trimmet med cutadapt (v3.4) i flere runder for å fjerne korte lesninger (<20 i lengde) eller lesninger som utelukkende bestod av adaptersekvenser. Readsene ble deretter justert til det menneskelige genomet ved hjelp av STAR (v2.6.0c), og BAM-filer ble indeksert med SAMtools (v1.11). Duplikatlesninger ble fjernet ved hjelp av umi_tools (v1.0.1). Til slutt ble justeringstelling utført ved hjelp av featureCounts i Subread (v2.0.3). Kvalitetskontroll ble utført ved hjelp av FastQC (v0.11.9) på flere mellomliggende stadier i prosessprosessen.
All videre bioinformatisk prosessering og visualisering ble utført i R (v4.2.3), primært ved bruk av Seurat (v4.4.0) arbeidsflyt.83 Derfor ble individuelle UMI-verdier og metadatamatriser transformert til Seurat-objekter. Gener uttrykt i mindre enn 30 % av alle fibrene ble fjernet. Prøver av lav kvalitet ble fjernet basert på en minimumsterskel på 1000 UMI-verdier og 1000 detekterte gener. Til slutt bestod 925 fibre alle kvalitetskontrollfiltreringstrinn. UMI-verdier ble normalisert ved bruk av Seurat SCTransform v2-metoden,84 inkludert alle 7418 detekterte funksjoner, og forskjeller mellom deltakerne ble regresert ut. Alle relevante metadata finnes i tilleggsdatasett 28.
Publisert: 10. september 2025